陈青青，李 柯，唐晓清,*，耿 丽，王 磊，彭雅萍

（1.南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095；2.句容市茅山仙草中药材专业合作社，江苏 句容 212404）

华东覆盆子（Rubus chingii Hu）为蔷薇科悬钩子属多年生灌木，主要分布于华东地区，其果实药食两用，具有补肾固精、养肝明目的功效[1]。目前果实药用价值深入研究不足，保健与食用方面的研究开发过少，成为国内华东覆盆子产业化进程的制约因素[2-3]。华东覆盆子叶具有治疗发烧、糖尿病、月经疼痛、腹泻和绞痛的功效[4]。 在枝叶更替过程中，需要大量的修剪，合理利用修剪的废弃枝叶有助于开发华东覆盆子的茎叶资源。

蔷薇科悬钩子属的果实富含酚类化合物且具有抗氧化力，Vanessa等[5]研究发现巴西树莓的总酚含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力显著高于樱桃和蓝莓，陆维克等[6]研究发现10 个树莓品种都表现较高的氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），ORAC值范围为172.71～205.17 μmol/g，具有抗氧化活性。华东覆盆子果实含鞣花酸、槲皮素及山柰酚-3-O-芸香糖苷等化学成分，这些成分被证明具有显著的清除自由基 能力[7-8]。吴峰华等[9]用不同溶剂提取华东覆盆子其果实，发现提取物的羟自由基清除能力（IC50=1.34 mg/mL） 高于2,6-二叔丁基对甲酚（2,6-d i-tert-buty l-4-methylphenol，BHT）（IC50=1.45 mg/mL）。研究发现，浆果类植物的叶片中酚类化合物含量明显高于果实，且具有更高的抗氧化活性[10-11]。Zhang Tiantian等[12]研究得出华东覆盆子叶的多糖相对于果实有更强的清除自由基能力及更好的抗炎、抗肿瘤效果，显示华东覆盆子叶具有潜在的利用价值。目前还鲜见报道华东覆盆子茎叶酚类成分的分析及抗氧化活性的比较。

因此，本研究测定华东覆盆子果、茎及叶的醇提物中总黄酮、总多酚和原花青素含量，并采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）联用技术分析果、茎及叶的主要酚类物质成分，采用分光光度法测定各部位的DPPH自由基清除率、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除率及铁离子总还原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）以比较各部位的抗氧化活性，旨在为开发华东覆盆子不同部位成为抗氧化剂提供理论参考，促进其果、茎及叶的综合利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

华东覆盆子茎、嫩叶和老叶于2019年5月15日采摘于句容市九板桥和朴园，105 ℃杀青5 min后，60 ℃干燥至恒质量；果为由绿变黄时采摘，置沸水中略烫取出晒干[1]， 经南京农业大学王康才教授鉴定为蔷薇科悬钩子属华东覆盆子（Rubus chingii Hu）的果、茎及叶。

芦丁、儿茶素、鞣花酸、没食子酸、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridy1)-1,3,5-triazine，TPTZ）、ABTS、水溶性VE（Trolox） 上海源叶生物科技有限公司；DPPH 美国Sigma公司；山柰酚-3-O-芸香糖苷、椴树苷 上海远慕生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-QU70A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；HK01-10BT超声波清洗机 上海汉克科学仪器有限公司；5810R离心机 德国艾本德股份公司；G2-XS超高液相色谱-串联质谱仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 华东覆盆子果、茎及叶的活性成分含量测定

1.3.1.1 样品处理

样品干燥后粉碎，过筛（100 目），取样品0.5 g，加入10 mL体积分数70%的甲醇，45 ℃、360 W超声提取30 min，反复提取2 次，合并滤液后置于4 ℃冰箱保存，此溶液即为提取液。

1.3.1.2 总酚含量测定

参照Kim等[13]的方法，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，得到曲线方程为：y=0.005 9x＋0.013（R2=0.996 2），结果以每克干物质中没食子酸当量表示。

1.3.1.3 总黄酮含量的测定

参照Siddhuraju等[14]的方法，以芦丁为标准品绘制标准曲线，得到曲线方程为：y=0.001 1x＋0.016（R2=0.998 3），结果以每克干物质中芦丁当量表示。

1.3.1.4 总缩合单宁含量的测定

参照Nakamura等[15]的方法，以儿茶素为标准品绘制标准曲线，得到曲线方程为：y=2.541 7x＋0.009 5（R2=0.996 7），结果以每克干物质中儿茶素当量表示。1.3.2 华东覆盆子果、茎及叶的酚类物质的UPLC-MS/MS分析

1.3.2.1 样品前处理

取1 mL提取液经0.22 μm微孔滤膜后转移至进样小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.2.2 标准溶液的配制

准确称取山柰酚-3-O-芸香糖苷，椴树苷、芦丁及鞣花酸标准品各10 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶液溶解定容至刻度，摇匀，过0.22 μm滤膜，制成1 mg/mL 溶液作为混合对照品溶液，在相同测定条件下，以标准品质量浓度为对照计算华东覆盆子果、茎及叶的目标物质的质量浓度。

1.3.2.3 色谱条件

采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm），流速0.30 mL/min。流动相A：含0.1%甲酸的超纯水，流动相B：含0.1%甲酸的甲醇溶液。采用梯度洗脱：0～0.5 min，100%～95% A，0%～5% B；0.5～11.5 min，95%～5% A，5%～95% B；11.5～13.5 min，5%～95% A，95%～5% B。

1.3.2.4 质谱条件

使用电喷雾源在正离子模式进行质谱分析，测定质量范围m/z50～1 200。重新校准时使用亮氨酸-脑啡肽（m/z556.28）锁定质量选项。毛细管电压为3.0 kV，样品锥为40 V，初始温度为120 ℃，脱溶气体温度为400 ℃，数据采集和处理采用Massynlyx4.1。

1.3.3 华东覆盆子果、茎及叶的抗氧化能力的测定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力测定

参照Chrysargyris等[16]的方法，对照品为Trolox，样品提取液对DPPH自由基清除能力以清除率达到50%时（IC50，μg/mL）所需要的样品质量浓度表示。DPPH自由基清除率按式（1）计算：

式中：A1为1 mL DPPH溶液、1.8 mL 70%甲醇溶液、0.2 mL样品溶液混合的吸光度；A2为2.8 mL 70%甲醇溶液和0.2 mL样品溶液混合的吸光度；A0为1 mL DPPH溶液和2 mL 70%甲醇溶液混合的吸光度。

1.3.3.2 ABTS阳离子自由基清除能力测定

参考Zhou Ying等[17]的方法，对照品为Trolox，样品提取液对ABTS阳离子自由基清除能力以IC50表示。ABTS阳离子自由基清除率按式（2）计算：

式中：As为3.9 mL ABTS工作液和0.1 mL 70%甲醇溶液混合均匀的吸光度；Am为3.9 mL ABTS工作液和0.1 mL样品溶液混合的吸光度。

1.3.3.3 FRAP测定

参照刘瑜新等[18]的方法，对照品为Trolox，FRAP以吸光度（A593nm）0.3时样品质量浓度（A0.3，μg/mL）表示，A0.3越小，FRAP越大。

1.4 数据处理

各处理3 次重复，结果以±s表示，用SPSS Statistics 17.0及Excel进行数据统计分析，用Origin 9软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同部位的总酚、总黄酮和原花青素含量

表1 华东覆盆子果、茎、嫩叶和老叶的总酚、 总黄酮和原花青素含量（n= 3）Table 1 Contents of total phenols, total flavonoids and procyanidins in fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n = 3)mg/g

由表1可知，华东覆盆子的果、茎、嫩叶和老叶总黄酮、总酚及原花青素含量具有显著差异（P＜0.05）。嫩叶的总酚含量和总黄酮含量均高于果和茎，分别是果的2.28 倍和1.91 倍，茎的1.71 倍和1.51 倍，差异性显著。与嫩叶相比，老叶的总酚含量比嫩叶低18.63%，而总黄酮含量最高，显著高于其他部位；果的总黄酮含量和总酚含量与其他部位相比均最低，仅为茎的74.82%和78.95%，而原花青素显著高于茎和叶（P＜0.05），分别是茎、嫩叶和老叶的2.61、3.04、4.04 倍；茎和嫩叶的原花青素含量相近，差异性不显著（P＞0.05），分别是老叶原花青素含量的1.54 倍和1.32 倍。总体上，各部位间的总酚含量为嫩叶＞老叶＞茎＞果，总黄酮含量为老叶＞嫩叶＞茎＞果，而原花青素含量为果＞茎＞嫩叶＞老叶。

Veljkovic等[19]对巴尔干中部地区的野生树莓种群研究发现叶的酚类含量高于果实，这与本实验结果一致。贾仕杰[20]和宁玮钰[21]等研究了6 种东北红树莓叶的原花青素发现，叶中的原花青素含量在1.8～3.06 mg/g之间，低于果实和果籽中的原花青素的含量，这与本实验果的原花青素含量高于茎叶的结果一致。而本实验中嫩叶及老叶的原花青素含量略高于贾仕杰等[20]所测的结果，可能与区域差异及样品采摘时间不同有关。

2.2 不同部位的酚类化合物分析

为进一步明确华东覆盆子各部位的酚类物质的具体组成，利用UPLC-MS/MS对提取液进行分析。由图1可知，果、叶及茎的内在组分具有差异，而嫩叶和老叶的内在组分相似。如表2所示，UPLC-MS/MS共分析出了18 种黄酮类化合物和3 种酚酸，嫩叶和老叶的酚类化合物组成相似，主要为山柰酚衍生物和槲皮素及其衍生物，果和茎中的黄酮类成分相对于叶较少，这与旷慧[22]和肖洪明[23]等的研究结果相似。本研究对相对含量较高的化合物进一步定性定量分析（图1～3、表3）。嫩叶中的山柰酚-3-O-芸香糖苷和芦丁含量最高，分别为茎的4.13 倍与23.25 倍，为果的4.38 倍与2 倍，不同部位间差异显著。茎中的椴树苷含量较高，为果的4.21 倍及老叶的6.65 倍，而与嫩叶差异不显著（P＞0.05）。实验发现果中的鞣花酸含量最高，达到了1 165.69 μg/g，分别为茎的1.57 倍、嫩叶的6.31 倍和老叶的4.82 倍，差异较大。老叶的没食子酸含量最高，达到了24.97 μg/g，与果差异显著，嫩叶和茎中的含量较少，无明显差异。

图1 样品的总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatograms of polyphenols in different parts of R. chingii Hu

图3 各标品的质谱碎片图Fig. 3 Mass spectrum of each standard

表2 华东覆盆子果、茎、嫩叶和老叶的酚类化合物鉴定结果（n= 3）Table 2 Identification of phenolic compounds in fruits, stems, young leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)

表3 华东覆盆子果、茎、嫩叶和老叶的3 种黄酮和 2 种酚酸含量（n= 3）Table 3 Contents of three flavonoids and two phenolic acids in fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)μg/g

2.3 抗氧化活性分析

DPPH法、ABTS法及FRAP法是评价体外抗氧化活性最可靠的方法之一，主要原理为抗氧化物质对自由基的清除能力以及对金属离子的还原能力，具有成本低廉、应用广泛、操作便利等优势[24-25]。研究发现，华东覆盆子果、茎、嫩叶及老叶的70%甲醇提取物均具有抗氧化活性，且嫩叶的DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力、FRAP均大于果、茎及老叶，具有最强的抗氧化活性，这与Veljkovic等[19]研究的结果一致。Ding[26]用DPPH法研究华东覆盆子果的抗氧化活性时，发现其IC50为17.9 μg/mL，强于抗坏血酸（IC50为23.2 μg/mL）。 吴峰华等[9]研究了华东覆盆子果不同提取部位的DPPH自由基清除能力，发现醇提物的IC50为17.7 μg/mL， 略高于BHT（12.5 μg/mL），与表4所示果的IC50（42.41 μg/mL）略有区别，可能是因为所测样品的产地来源及采收时间不同所致。Wang等[27]研究了黑莓、草莓以及5 种悬钩子属植物的嫩叶及老叶酚类含量和抗氧化活性，发现叶片的酚类含量和抗氧化活性高于果实，叶片中嫩叶的酚类含量和抗氧化活性又远高于老叶，与本实验所测结果一致。

表4 华东覆盆子果、茎、嫩叶及老叶提取物的抗氧化活性比较（n=3）Table 4 Antioxidant activities of extracts from fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu (n= 3)

2.3.1 DPPH自由基清除能力分析

图4 4 种样品提取物的DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH-scavenging activities of four sample extracts

如图4所示，当样品质量浓度逐渐增加时，4 种样品提取物的DPPH自由基清除速率呈现快速上升后趋于平缓的趋势，当清除率低于90%时，样品的自由基清除率与质量浓度具有明显的量效关系。其中，嫩叶的清除能力最强，在质量浓度为40 mg/mL时，清除率达到了91%，其IC50为16.99 μg/mL，清除能力弱于对照Trolox （4.84 μg/mL）；其次是老叶提取物（22.61 μg/mL）和茎提取物（29.94 μg/mL），果提取物清除能力较弱，IC50值最高（42.41 μg/mL），是嫩叶提取物的2.49 倍，老叶的1.87 倍及茎的1.40 倍，与其他部位具有明显差异。

2.3.2 ABTS阳离子自由基清除能力分析

如图5 所示，华东覆盆子果、茎、嫩叶及老叶的ABTS阳离子自由基清除能力变化趋势与DPPH自由基清除能力的变化趋势相似，在样品质量浓度为30～1 800 μg/mL时，随着样品的质量浓度增加，ABTS阳离子自由基清除率逐渐上升，具有明显的剂量依赖性。果的IC50在4 种样品提取液中最高，说明果的自由基清除能力最低，嫩叶的自由基清除能力最强，IC50仅为514.00 μg/mL，约为果的1/3，与果、茎及老叶达到了显著差异，而老叶的IC50值小于茎，说明老叶的清除能力强于茎，总体看来，ABTS阳离子自由基清除能力大小依次为嫩叶＞老叶＞茎＞果。

图5 4 种样品提取物的ABTS阳离子自由基清除能力Fig. 5 ABTS cation radical scavenging activities of four extracts

2.3.3 FRAP分析

图6 4 种样品提取物的FRAP Fig. 6 Ferric ion reducing power of four extracts

如图6可知，提取物的吸光度的变化趋势与前面2 种抗氧化评估方法变化趋势相同。4 种提取物A0.3依次为果＞茎＞老叶＞嫩叶，其中嫩叶的还原能力最强，A0.3值最小，仅为39.06 μg/mL，其次是老叶和茎，A0.3值为46.51 μg/mL和58.80 μg/mL，果的总还原能力较差，具有最高的A0.3值。总体看来，FRAP大小依次为嫩叶＞ 老叶＞茎＞果。

2.4 华东覆盆子果、茎、嫩叶及老叶提取物的化学成分成分与抗氧化活性的相关性分析

表5 华东覆盆子果、茎、嫩叶及老叶提取物活性成分与其 抗氧化活性的相关性分析Table 5 Correlation analysis between bioactive components and antioxidant capacity of extracts from fruits, stems, tender leaves and old leaves of R. chingii Hu

以样品质量浓度40 μg/mL测定DPPH自由基清除率；以样品质量浓度测1 500 μg/mL定ABTS阳离子自由基清除率。如表5所示，总酚含量与DPPH自由基清除能力有极显著相关性，与ABTS阳离子自由基清除能力及FRAP显著相关，说明各部位的抗氧化活性与总酚含量显著相关，即总酚对各部位的抗氧化活性的贡献最大，鞣花酸是浆果类的主要酚酸，研究发现鞣花酸和没食子酸是华东覆盆子的主要酚酸[28]。鞣花酸含量、没食子酸含量及原花青素含量与DPPH自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力及FRAP都呈负相关，说明鞣花酸、没食子酸及原花青素对总酚的抗氧化活性无显著贡献。原因一可能是果实与茎叶的成分种类和含量的差异较大[28-29]，果实中的鞣花酸和原花青素含量虽然高于嫩叶和老叶，但是总黄酮含量和种类远低于嫩叶和老叶，由此导致果和茎的抗氧化能力小于嫩叶和老叶，使相关性分析出现了负值。原因二可能是原花青素自身发生了氧化聚合，从而减弱了自身的抗氧化活性，这与代沙[30]研究发现紫苏的原花青素含量和脂质过氧化抑制率呈负相关的结果一致。酚类化合物除了酚酸和原花青素，还包括黄酮化合物[31]。实验发现总黄酮含量与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力及FRAP相关性达到了0.900、0.863及0.835；山柰酚-3-O-芸香糖苷与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力及FRAP相关性也达到了0.9以上，且总黄酮含量与总酚含量相关性达到了0.914，山柰酚-3-O-芸香糖苷与总酚含量显著相关。说明总酚的抗氧化活性极可能是由总黄酮所贡献，这与贾仕杰等[20]得出东北树莓总酚的抗氧化活性是由总黄酮呈了较高贡献作用的结论一致。由于实验中存在未知酚类物质的影响，无法断定鞣花酸和总原花青素对总酚的抗氧化活性影响是否起到了相反的作用，因此仍需深入研究。

3 结 论

华东覆盆子果、茎、嫩叶及老叶含有丰富的酚类化合物，相对于果和茎，叶具有更高含量的总酚和总黄酮，其中的山柰酚-3-O-芸香糖苷及芦丁等黄酮类成分含量也最高。而茎中具有较高含量的椴树苷，果中的鞣花酸含量最高，果、茎及叶可作为这些化合物的提取潜在来源。体外抗氧化结果表明华东覆盆子嫩叶及老叶的抗氧化活性大于茎和果，嫩叶的抗氧化能力强于老叶。相关性显示，总酚对抗氧化活性贡献最高，因此，嫩叶的酚类化合物可作为潜在的天然抗氧化剂，具有一定的保健品开发潜力。