丁习林，王桂瑛,，邹颖玲，赵娅英，葛长荣，廖国周,

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南 昆明 650201）

宣威火腿是云南传统名特优肉制品[1]，以营养丰富、滋味鲜美、油而不腻、香气浓郁著称于世。多年来，由于产品含盐量普遍较高，口感偏咸，严重影响其消费及火腿产业的发展。食盐是目前导致高血压和心血管疾病等的一个重要因素[2-4]，降低钠盐摄入量可有效降低血压和患中风以及冠心病的风险[5-6]。因此，有必要减少宣威火腿中的钠盐含量，降低消费者食盐摄入量或使用钠盐的替代物，以满足消费者对宣威火腿的健康要求。

国内外学者通过降低肉制品中NaCl的添加量和利用其他盐部分替代NaCl[7]。然而，NaCl在干腌火腿中具有重要的作用[8]，减少火腿中NaCl添加量具有挑战性。有研究表明，用替代盐部分替代NaCl似乎是降低干腌火腿钠含量的最佳选择[9]。而KCl与NaCl性质较为相似，大量研究表明，适宜替代量的KCl对干腌肉制品的品质不会产生明显的不利影响[10-11]。在满足低钠干腌火腿要求的前提下，其风味是评价火腿品质的主要指标之一。目前，火腿风味的鉴定与表征常采用气相色谱-质谱联用和液相色谱[12]。现有技术中也有使用电子鼻进行评定[13-15]，但是检测的精密度较差，成分难以定性。与其他技术相比，气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技术是基于GC中不同的气相离子在电场中迁移速率的差异检测痕量气体和表征化学离子物质的分析技术。该检测技术克服IMS技术分离度差的局限性，使得离子迁移谱信号响应经GC预分离后质量上得到显著改善[16]，通过GC保留时间和IMS漂移时间具有实现二维分离的潜力。具有灵敏度高、分析速度快、操作简单等优点，且样品几乎不需要任何前处理。由于其相对于传统分析技术的诸多优势，近年来在食品质量和食品安全方面的应用不断增加，包括食品掺假及产地的鉴别、新鲜度和贮存条件的判定、质量评价和优化、食品成分分析等[17-19]。GC-IMS已被证明可用于分析和表征不同性质样品（如肉制品）中的挥发性化合物[20-21]。 同时，结合多元统计学方法，主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等分析不同KCl替代组中挥发性风味的差异。

本研究通过使用不同比例KCl部分替代NaCl，采用GC-IMS技术对不同KCl替代盐火腿中的挥发性风味物质进行检测。结合PCA和PLS-DA等多元统计分析方法，分析不同KCl替代量的宣威火腿挥发性风味的差异，旨在为低钠盐宣威火腿的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用同批次饲养10月龄的含乌金猪血统的宣和猪，统一屠宰后取猪后腿25 条作为原料腿，平均腿质量为（14.77±0.72）kg。于云南省宣威市浦记食品火腿有限公司进行腌制发酵成熟。所有分离用有机溶剂、滴定标准液及指示剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec®食品风味分析与质量控制系统（配有自动顶空进样器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析软件及GC-IMS Library Search定性软件） 德国G.A.S 公司；BZBJ-20型斩拌机 杭州艾博科技工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 试验设计

采用单因素试验设计，将25 条猪后腿随机分成5 组，每组5 条。根据国内外干腌肉制品KCl替代NaCl比例的相关研究，替代的最大可接受比率在50%～60%[22-23]之间，结合已有研究结果设计KCl的替代比例。以100% NaCl为对照，使用KCl分别替代30%、40%、50%和60% NaCl的宣威火腿。

1.3.2 宣威火腿的加工

按照传统宣威火腿的加工工艺进行。各组不同替代量KCl分别与对应的食盐混合，腌制时食盐和钾盐的添加量为鲜腿质量的6.5%。其工艺流程主要包括：修割定型、上盐腌制、堆码翻压、洗晒整形、上挂风干和发酵管理等基本步骤。将鲜猪腿在0～4 ℃冷却48 h，经冷藏并修割定型的鲜腿上盐腌制，分3 次上盐，每次间隔2～3 d，腌制间室内温度保持在7～10 ℃之间，相对湿度保持在65%～80%之间；堆码腌制12～15 d，每隔3～5 d翻压一次；经堆码翻压的腌制腿洗晒整形后进行上挂风干，后期发酵平均温度保持在13～16 ℃之间，相对湿度保持在72%～80%之间。加工时间从2017年11月到2018年11月。火腿的加工及发酵均于云南省宣威市浦记食品火腿有限公司进行。

1.3.3 样品制备

宣威火腿经洗霉修割后分别取各组火腿股二头肌为样品，除去脂肪和结缔组织，用斩拌机斩碎后，可直接用于检测。每组取3 个样品，共15 个样品用于GC-IMS分析，其中每个样品平行测定2 次。

1.3.4 GC-IMS测定

采用GC-IMS气味分析仪对不同替代盐火腿样品产生的挥发性有机物进行检测分析。取1 g样品于20 mL顶空进样瓶中，60 ℃孵化20 min，经顶空进样用GC-IMS仪FlavourSpec®进行测试，经G.A.S.开发的功能软件分析可给出样品中挥发性有机物的差异谱图；软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。GC-IMS分析的主要检测参数如表1所示。

表1 GC-IMS分析参数Table 1 Working parameters for GC-IMS analysis

1.4 数据处理

采用设备自带仪器分析软件， 包括L A V（Laboratory Analytical Viewer）和插件（Reporter、Gallery plot），以及GC×IMS Library Search定性分析软件对不同替代盐火腿的挥发性有机物进行采集和分析；SIMCA-P14.1用于PCA和PLS-DA；热图和聚类分析采用TBtools软件绘制。

2 结果与分析

2.1 不同KCl替代组宣威火腿中挥发性化合物的 GC-IMS分析

采用顶空-GC-IMS对不同替代盐火腿挥发性化合物进行分析和鉴别。GC-IMS能确定3 个独立的参数，即分析物在气相色谱柱中的保留时间、离子化合物在IMS漂移管中的分离时间、每个离子化合物到达IMS漂移管检测器的量（信号强度），这些数据可以用三维图表示。不同迁移率的离子需要不同的时间通过固定的距离（漂移管长度）向检测器漂移，因此在不同时间（漂移时间）内被检测。在漂移过程中，离子与漂移气体的中性分子发生碰撞。与小分子相比，大分子在相同时间内会发生更多的碰撞，因此它们的漂移速度较慢[24]。

采用GC-IMS分析不同KCl替代盐火腿样品中挥发性成分的差异，如图1所示，从不同替代组火腿样品中各选取1 个样品，整个谱图即代表了样品的顶空成分，反应离子峰（reaction ion peak，RIP）两侧的每个点代表从样品中提取的挥发性化合物。颜色代表物质的含量，浅蓝色表示低含量，红色表示高含量，颜色越深表示含量越高。不同KCl替代组的火腿间挥发性组分可通过GC-IMS技术很好分离，且可直观看出不同替代组的挥发性化合物差异。不同替代盐的火腿挥发性有机物的差异主要表现在离子峰的位置、数量、强度及时间上。

2.2 不同KCl替代组宣威火腿中挥发性化合物差异分析

为进一步直观观察不同KCl替代组宣威火腿的挥发性有机化合物的变化，根据火腿挥发性物质GC保留时间和离子迁移时间对挥发性组分进行定性分析，然而，在GC-IMS中，许多挥发性物质由于浓度不同会产生不同的产物离子，如单体、二聚体和异构体，这些产物的保留时间相似，但漂移时间不同。通过软件内置的NIST 2014保留指数数据库与G.A.S.的IMS迁移时间数据库，确定49 种具体挥发性物质组成（图2， 表2），主要包括醛类19 种、醇类9 种、酮类11 种、酯类9 种和酸类1 种。

图1 不同KCl替代组宣威火腿中挥发性化合物的GC-IMS图谱Fig. 1 GC-IMS profiles of volatile compounds in Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

图2 宣威火腿样品中挥发性化合物特征峰位置点Fig. 2 Characteristic peak location points of volatile compounds in Xuanwei ham samples

表2 宣威火腿挥发性组分的定性Table 2 Volatiles in Xuanwei ham identified by GC-IMS

续表2

为进一步比较不同替代盐火腿中挥发性有机物质的差异，G.A.S.公司开发的LAV软件的Gallery Plot插件，可选取图中待分析区域，自动生成指纹图谱。选取的区域编号与图2和表2中的标记编号一一对应。如图3所示，每个特征峰的颜色代表强度，蓝色为背景，红色代表物质成分，红色越深表示含量越高。根据检测到的风味化合物，所建指纹图谱清晰地反映不同KCl替代量的宣威火腿各类风味化合物的差异。40% KCl替代组中丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、乙酸乙酯的含量较高；乙缩醛在40%～60% KCl替代组中，而在对照组（100% NaCl）和30% KCl替代组中含量最低；此外，在本研究中，对照组和30% KCl替代组中的己醛含量明显高于其他替代组；壬醛、正辛醛和戊醛等在对照组中含量较高，而在使用了KCl替代后其含量明显低于对照组。

图3 不同KCl替代组宣威火腿中挥发性化合物的指纹图谱Fig. 3 Fingerprints of volatile compounds in Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

2.3 不同KCl替代组宣威火腿中挥发性化合物多元统计分析

2.3.1 基于PCA对不同KCl替代组宣威火腿的区分

图4 PCA得分图（A）和Hotelling T2分布图（B）Fig. 4 PCA score plot (A) and Hotelling T2 value range plot (B)

近年来，随着风味检测技术的发展和多元统计分析技术的普及，统计分析方法被广泛应用于肉制品的化学识别及其风味特征成分的研究。PCA可以根据主成分因子在不同样本中的贡献率评价样本之间的规律性和差异性[25]。利用火腿挥发性风味组分的信号峰强度进行PCA，如图4A所示，共获得4 个PC，累计＝0.685，Q2＝0.418，虽然模型拟合性较好，但由于Q2小于0.5，表明模型预测能力较差。从样本的聚集、离散程度可知，不同KCl替代组宣威火腿样本分布均有聚集的部分，也均有离散的部分，表明火腿样本中均存在差异较大的样本，因为样本分布点距离越近，说明这些样品中所含有的化合物的组成和含量越接近，而这些化合物的组成和含量接近可能是相同处理组间的聚集，也有可能是不同处理组但是化合物含量上相近；反之，样本点距离越远，其差异就越大，这与以上Q2数值较小的原因一致。但是所有样品均处于95% Hotelling T2置信区间内，没有发现“离群样本点”，如图4B所示。PCA属于无监督分析方法，不能忽略组内误差、消除与研究目的无关的随机误差，因此，并不能直接区分不同KCl替代组的宣威火腿，之后将采用有监督的方法进行进一步研究。

2.3.2 基于PLS-DA对不同KCl替代组宣威火腿的区分

图5 不同KCl替代组宣威火腿PLS-DA得分图（A）和置换保留图（B）Fig. 5 PLS-DA scores plot (A) and permutations plots (B) of Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

PLS-DA是基于降维的多维向量分析方法，与PCA不同的是，PLS-DA为有监督的分析，可以预设分类，弥补了PCA方法的不足，强化组间的差异，同时可以量化特征化合物造成组分差异的程度[26-27]。如图5A所示，累计R2X＝0.784，R2Y=0.947，Q2＝0.791，说明该模型对不同KCl替代组宣威火腿具有良好的稳定性和较好的预测能力，相比于PCA，PLS-DA使组间差异更明显。采用置换检验对PLS-DA模型进行验证（重复次数200），以获取随机模型的R2和Q2，可作为衡量模型是否过拟合以及在评估模型的统计显著性上有重要作用。如图5B所示，最右侧的R2和Q2值均高于左侧的R2和Q2值，R2＝0.46，Q2＝-0.825，Q2为负值表明回归线与横坐标交叉或小于0， 从而证明该PLS-DA模型可靠，未存在过拟合现象，且有较好预测能力[28]，可以用于解释不同KCl替代量的宣威火腿风味的差异。

2.3.3 不同KCl替代组宣威火腿挥发性特征标志物的筛选与分析

基于P L S-D A 模型分析结果，变量重要性投影（variable important for the projection，VIP）可以量化PLS-DA的每个变量对分类的贡献，通常将VIP值大于1表示在判别过程中具有重要作用。VIP值越大，变量在不同KCl替代组火腿间的差异越显著[29]。其中，以VIP大于1为潜在的挥发性特征标志物，共筛选出24 个潜在的挥发性特征标志物（表3），包括醇类5 种、醛类6 种、酯类6 种和酮类7 种。为了直观观察不同KCl替代组宣威火腿风味标志物的差异，依据每个风味标志物的峰强度值绘制热图。如图6所示，100% NaCl（对照组）和30% KCl替代组的风味标志物聚为一类，40%～60% KCl替代组的风味标志物聚为一类，其中I区的风味标志物其含量随KCl替代量的增加有逐渐减低的趋势；II区的风味标志物其含量在不同KCl替代组间的变化主要呈现先增加后降低的趋势，在40% KCl替代组中达到最大。

从表3可知，以峰强度值代表各挥发性化合物含量的高低，特别是丙酸乙酯、2-戊酮（M）、乙酸乙酯（D）和乙缩醛等，其VIP值大于1.2，是影响不同KCl替代组宣威火腿风味差异的重要成分。其中，丙酸乙酯在40% KCl替代组中的含量最高，且显著高于对照组和其他替代组（P＜0.05），除40% KCl替代组外，各实验组间均无显著差异（P＞0.05）。2-戊酮（M）含量在对照组中最低，KCl的替代使2-戊酮（M）的含量显著增加 （P＜0.05）。乙酸乙酯（D）含量随KCl替代量的增加呈先增加后降低的趋势，在40% KCl替代组中达到最大。乙缩醛在对照组和30% KCl替代组中含量极低，而当KCl的替代量达到40%及其以上时，其含量与对照组和30% KCl替代组相比显著增加（P＜0.05）。3-甲基丁醛是重要的甲基醛，当KCl替代量超过30%时，3-甲基丁醛显著降低（P＜0.05）。此外，1-辛烯-3-醇、异丁酸乙酯（M）、2-戊酮（M）、2-戊酮（D）和4-甲基-2-戊酮（M）等均在对照组中含量最低，而KCl的替代使其含量增加。同时，KCl的替代也会使一些挥发性风味物质含量显著降低，如芳樟醇、苯甲醛、2-丁酮（M）等。

表3 不同KCl替代组宣威火腿风味特征标记物峰强度值Table 3 Peak intensity values of characteristic marker flavor substances in Xuanwei hams with different levels of KCl substitution

图6 不同KCl替代组宣威火腿风味特征标记物热图和聚类分析图Fig. 6 Cluster heat map of characteristic marker flavor substances in hams with different levels of KCl substitution

3 讨 论

在宣威火腿的加工过程中，NaCl发挥了重要的作用，它会影响蛋白与脂肪的分解氧化等化学和生化反应，最终影响火腿风味的形成[30]。NaCl含量的变化会导致干腌肉制品风味的变化[31]。本研究检测出的风味化合物主要包括醛类、醇类、酮类、酯类和酸类等。其中醛类物质由于风味阈值较低，在整个产品风味中起着至关重要的作用[32]，即使微量，也是火腿中最重要的一类风味化合物[33-34]。唐静等[35]通过气味活度法对金华火腿风味进行检测鉴定，得到11 种主体挥发性化合物，其中 3-甲基丁醛、辛醛、壬醛、庚醛、己醛等在本实验中也有检出。苏伟等[36]通过PLSR相关性分析显示，肉香与 3-甲基丁醛、己醛及壬醛含量有关。在本实验中，己醛含量在KCl替代量超过30%时明显降低，这与Armenteros等[9]的研究结果一致。2-甲基丁醛和3-甲基丁醛是蛋白水解及亮氨酸和异亮氨酸经Strecker降解的产物，具有奶酪、坚果和成熟火腿的气味，且对火腿的整体风味有重要贡献[37]。在本研究中当KCl替代量超过30%，3-甲基丁醛含量低于对照组，这可能是由于KCl较高比例替代NaCl抑制了蛋白质水解，从而抑制了火腿中氨基酸的生成。Wu Haizhou等[38]发现70% KCl替代NaCl抑制了干腌培根中蛋白质水解。

醇类物质由于其风味阈值相对较高，对干腌火腿总体风味的贡献较小[39]。其中比较具有代表性的是脂肪酸β氧化的产物1-辛烯-3-醇，它具有蘑菇味香气，香气阈值较低，是火腿中重要的香气成分，在本研究中1-辛烯-3-醇在对照组中最低，而KCl的替代使其含量增加，这与唐静[37]使用40% KCl替代干腌火腿中的结果基本一致，可能是因为KCl能够促进脂肪的氧化，进而促进1-辛烯-3-醇的生成。

有些风味化合物可由多种途径产生，氨基酸降解、脂肪氧化以及由于微生物的作用等，如丙酮等一些小于6 个碳原子的脂肪族化合物[40]。有研究认为[41]酮类化合物尤其是2-酮类化合物对肉类和肉制品的风味有重要作用。在本研究中，2-戊酮是重要的风味特征标记物，KCl的替代均使2-戊酮的含量显著增加，Zhang Yingyang等[33]的研究中也得到类似的结论。酯类化合物是一种重要的挥发性化合物，由于其阈值较低，使得发酵肉制品具有独特的风味[42]。在本研究中酯类风味标记物质均呈现出随KCl替代量的增加其含量呈先增加后降低的趋势，因为在火腿中一定浓度的KCl可能会加速蛋白质水解[43]，生成更多的醇类，并与游离脂肪酸反应形成更多的酯类，这与Zhang Yingyang等[33]研究结果基本一致，而随后降低则可能是由于水分含量的增加导致。此外，KCl替代量不超过60%时，苯甲醛含量随钾盐替代比增加而降低， 童红甘[44]在钾盐替代对传统板鸭风味品质的影响研究中也得到类似的结论。

4 结 论

本研究采用GC-IMS对KCl不同替代量宣威火腿中的挥发性成分进行分析检测，共定性识别出了49 种挥发性化合物，包括醛类19 种、醇类9 种、酮类11 种、酯类9 种和酸类1 种。同时结合多元统计学方法分析不同KCl替代组宣威火腿中的挥发性成分的变化，通过PCA、PLS-DA均可直观对不同KCl替代组宣威火腿中的挥发性成分进行有效区分，利用PLS-DA建立的相关模型，得出VIP相关物质共24 种，其中丙酸乙酯、2-戊酮（M）、乙酸乙酯（D）和乙缩醛等，是影响不同KCl替代组宣威火腿风味差异的重要成分。此外，通过热图聚类分析，对照组与30% KCl替代组宣威火腿在风味上较为相似，当KCl替代量超过30%，3-甲基丁醛含量低于对照组，此外，1-辛烯-3-醇、异丁酸乙酯（M）、2-戊酮（M）、 2-戊酮（D）和4-甲基-2-戊酮（M）等均在对照组中最低，而KCl的替代使其含量增加。乙酸乙酯、异丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯等酯类化合物在30%和40% KCl替代组中含量较高，但当KCl的替代量超过40%时，其含量降低。KCl部分替代NaCl改变了宣威火腿挥发性化合物的形成，最终影响了火腿的风味。综上，为了保持传统宣威火腿的风味，KCl替代量不应超过30%，因此，可减少30%的NaCl添加量，有助于生产低盐健康的宣威火腿。