王乐飞，古绍彬,2，吴 影,2,

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南省食品微生物工程技术研究中心，食品加工与安全国家级实验教学示范中心，河南 洛阳 471023）

枣（Zizyphus jujubaMill.）是鼠李科枣属植物，在我国具有6 000余年的种植历史，并广泛分布在欧洲、南亚和东亚、澳大利亚等地[1]。迄今为止，中国已发现700余枣树品种[2]。中国是唯一的枣果出口国家，它的种植面积已达150万 公顷，年产新鲜枣果420万 t[3]。枣果含有丰富的生物活性物质，具有良好的营养和保健价值，可直接食用，也可用作食品添加剂和调味剂[4]。研究表明，枣果含有多种营养成分，包括三萜酸、黄酮、磷脂、氨基酸、酚酸、矿物成分和多糖[5-10]，具有增强免疫力、抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗炎杀菌、镇静等多种作用[11-14]。

枣果是含有黄酮类化合物的“木本粮食”之一，对人类饮食具有重要贡献[15-16]，黄酮类化合物是植物次生代谢产物的重要组成部分，包括花青素、黄烷类、黄酮、黄烷酮、黄酮醇和查尔酮等[17]。研究表明黄酮类化合物具有许多生物学功能和保健作用，如抗氧化、抗糖尿病、抗炎和降低高血压[18-19]。此外，黄酮类化合物与果皮颜色密切关联[20-22]，黄酮类化合物是重要的水溶性色素，是很多水果呈现红色的原因，包括苹果、葡萄、草莓和 荔枝[23-25]。尽管人们对黄酮类化合物抗氧化活性研究较为深入和系统，但有关黄酮类化合物种类、含量及变化规律与枣果皮颜色间的内在关系却鲜见报道[26]。

为研究枣果皮颜色变化和黄酮类化合物间的内在关系，采用超高效液相色谱-质谱联用（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）技术，结合代谢组学分析方法[27]，选取颜色区分显明的3 个发育阶段（即“三变红”枣），分析黄酮类化合物的种类和含量与颜色变化的关系。利用主成分分析（principle component analysis，PCA）[28]，初步区分3 个不同的发育阶段，继而通过正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA），对不同阶段黄酮类化合物进行判别分析，通过聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）3 个不同发育阶段黄酮类化合物的组成及含量的分布规律，并对关键黄酮代谢物筛选[29]。本研究可更好地理解枣果发育过程中形成颜色的黄酮类物及枣果特性，对揭示“三变红”枣果着色机理具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“三变红”枣果来源于河南科技大学实习基地，如图1所示，发育阶段S1为紫红色、S2为绿白色、S3为深红色，分别对应于开花后的第30、95、120天形态。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 德国Meker公司。

图1 “三变红”枣果实发育的颜色变化Fig. 1 Color changes during fruit development of “Sanbianhong” jujube

1.2 仪器与设备

6500 QTRAP UPLC-MS仪 美国AB Sciex公司；MM 400研磨仪 德国Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集和预处理

为了使统计数据更加准确，随机选取表型性状稳定，具有相似的活力、树龄和高度的3 棵枣树，每棵枣树作为1 个样品，进行了立体采样，在枣树的东西南北4 个方向采样，S1、S2、S3期分别采集枣果40 g左右，去掉果核，用小刀轻轻刮去枣肉，直到无肉眼可见明显果肉，获得枣皮后，利用研磨仪磨枣皮（30 Hz，1.5 min）至粉末状，称取100 mg的粉末，溶于1.0 mL提取液（70%的甲醇溶液）中，溶解后样品放置4 ℃冰箱12 h，每隔4 h涡旋1 次，共涡旋3 次，以提高提取率， 10 000×g离心10 min，吸取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于UPLC-MS分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）；流动相：A为体积分数0.04%乙酸溶液，B为体积分数0.04%乙酸-乙腈溶液；洗脱梯度：0～11 min，95% A，5% B；11～12 min，95%～5% A，5%～95% B；12～15 min，5%～95% A，95%～5% B；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源温度500 ℃，质谱电压5 500 V，气帘气25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。在三重四极杆中，每个离子对根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

1.3.4 黄酮类化合物分析

1.3.4.1 定性分析

利用软件Analyst 1.6.1进行数据采集，基于自建数据库MWDB（含有5 000 种以上小分子化合物的一级和二级图谱）及代谢物信息公共数据库（ChemBank：http://chembank.med.harvard.edu/compounds；pubchem：https://pubchemblog.ncbi.nlm.nih.gov/；NIST Chemistry Webbook：http://webbook.nist.gov/）。根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含K＋、Na＋、NH4＋的重复信号，以及本身是其他更大分子质量物质的碎片离子的重复信号。

1.3.4.2 定量分析

黄酮物质定量是利用三重四极杆质谱的多反应监测模式分析完成。对于已鉴定的黄酮类化合物，计算一级质谱中的提取离子色谱峰的峰面积，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正[30]，对枣果皮黄酮类化合物的相对含量进行比较分析。

1.3.4.3 总黄酮含量的测定

1）标准曲线的制作

分别吸取0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL的芦丁标准溶液（0.528 mg/mL）于5 个25 mL容量瓶中，加入12.5 mL体积分数为70%的乙醇溶液、0.7 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，摇匀后静置5 min，加入0.7 mL质量分数为10%的Al(NO3)3溶液，静置6 min后，再加入5 mL 1 mol/L 的NaOH溶液，摇匀后用体积分数70%的乙醇溶液定容，10 min后以试剂空白为参比，在510 nm波长处测定各标准溶液的吸光度。

2）样品总黄酮含量的测定

从枣皮黄酮提取物中准确吸取0.5 mL，置于25 mL容量瓶中，测定其在510 nm波长处的吸光度，然后按下式计算总黄酮含量（以干质量计）：

1.4 数据分析

使用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 23.0（IBM Corporation，Armonk，NY，USA）进行统计分析。使用单因素方差分析（ANOVA）和Duncan倍数进行统计学评估确定显著异，P＜0.05，差异显著。使用OriginPro 2016和Adobe Illustrator CC绘制图片，HCA、PCA和OPLSDA，使用R（http://www.r-project.org/）进行[31]。

2 结果与分析

2.1 “三变红”果实发育过程中枣皮总黄酮含量定量分析

图2 “三变红”3 个不同发育阶段枣皮总黄酮的含量分析Fig. 2 Total flavonoid contents at three different developmental stages of “Sanbianhong” jujube

如图2所示，3 个不同发育时期，S1的总黄酮含量略高于S3（P＞0.05），但显著高于S2（P＜0.05），达到4.94 mg/g。S3中总黄酮含量为4.45 mg/g。S2的总黄酮含量最低，仅为0.95 mg/g。在“三变红”枣果S1～S3不同发育时期，枣果颜色从深到浅再到深，总黄酮含量变化趋势与之相同，从高到低再到高，表明总黄酮含量与枣果皮颜色变化呈正相关。

2.2 枣果不同发育时期的黄酮代谢判别分析

基于枣果实不同发育时期总黄酮含量建立了PCA模型（图3A），由于采用无监督的降维分析方法，统计分析结果表明，总黄酮无法以不同发育时期为指定变量获得较好聚类效果。为此，采用OPLS-DA法，通过对不同处理样本（如观测样本、对照样本）的特性分别进行训练，产生训练集，并预先对所需的观察变量进行分组，然后根据组别性质对数据进行统计分析，从而精确获悉影响分组的关键变量。以R对枣果不同发育时期总黄酮相对含量为基础进行分析，建立了OPLS-DA模型，如图3B所示，该OPLS-DA模型将枣果3 个不同发育时期清楚地区分开，且重复的样品紧凑地聚集在一起，从而表明该实验的可重复性和可靠性。PC1解释了总变量的53.9%，PC2解释了总变量的19.3%，累计贡献率达到73.2%，2 个PC可很好地解释总体变量的情况。由于当变量数大于样品数时，使用有监督判别方法进行分析时易产生过拟合现象，因此采用了置换检验法对OPLS-DA在无差异情况下的建模效果进行了考察（n=200，即进行200 次排列实验），结果如图3C所示。通过对OPLS-DA进行排列验证，Q2为0.963，远大于0.5，结果表明该模型拟合优异，且R2Y大于Q2，R2Y和Q2的差值小于0.3，表明该模型的解释度和预测度较优。

图3 枣果不同发育时期PCA得分图和OPLS-DA得分图及其验证模型Fig. 3 PCA score plot, OPLS-DA score plot and verification model for total flavonoid contents at different developmental stages of jujube fruit

2.3 黄酮类化合物差异代谢物筛选

基于OPLS-DA结果，获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影（variable importance in project，VIP）初步筛选出不同样品的差异代谢物；同时结合差异倍数值（fold change，FC）进一步精选出差异代谢物。通常认为FC≥2或FC≤0.5，同时VIP≥1的代谢物为差异代谢物；其中FC≥2或FC≤0.5表示代谢物在对照组和实验组中差异为2 倍以上或0.5以下，当FC≥2表示差异上调，FC≤0.5则表示差异下调；VIP值则表示对应代谢物组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，VIP≥1的代谢物为差异显著。基于VIP和FC值，得出差异代谢物的火山图（图4）。

通过S1和S2比较，发现26 种差异代谢物，其中24 种下调，2 种上调，说明从幼果S1期紫红色到白熟S2期绿白色，色泽逐步减退，黄酮类化合物大部分下调，通过S3和S2比较（图4B），发现26 种差异代谢物，其中21 种下调，5 种上调，与成熟期S3相比，白熟期S2的酮类化合物大部分下调，与颜色的变浅保持一致。通过S1和S3比较（图4C），发现6 种差异代谢物，3 种含量下调，3 种含量上调，S1和S2颜色差异不大，枣黄酮类化合物上调和下调的数量一致。本研究结果表明，枣黄酮类化合物随着颜色的变化而变化，当颜色变深时，黄酮类化合物大部分上调，颜色变浅时，呈现下调的趋势。Park等[32]研究证实色素分子的含量和种类是决定植物颜色的主要因素。Wang Aimin等[33]研究发现甘薯黄酮类化合物的种类与甘薯呈色呈现明显相关性，其中紫色甘薯中糖基化黄酮和金圣草素含量较为丰富，黄色甘薯和白色甘薯黄酮类物质含量明显低于紫色甘薯。Li Jing等[29]研究结果表明红花荞麦叶片中总黄酮的含量与色泽深度呈正相关，红花荞麦叶片黄酮类物质含量最高，达到223.04 mg/g，而当黄酮类物质低于 223.04 mg/g时，色泽偏弱。

图4 黄酮类化合物差异代谢物火山图Fig. 4 Volcano map of differential flavonoid metabolites

2.4 “三变红”不同发育时期关键成分的HCA

图5 3 个不同发育时期枣黄酮差异代谢物热图Fig. 5 Heat map of differential flavonoid metabolites among three fruit developmental stages

为更清晰探究“三变红”枣果在发育过程中的颜色变化与黄酮类化合物的关联特征，进一步采用HCA对关键黄酮类化合物进行分析。如图5所示，这些关键差异性成分在S1、S2、S3中的含量分布上呈现一定的规律特征（图中化合物相对含量从绿色到红色为逐渐升高）。S1中的黄酮类代谢产物与S2和S3形成鲜明对比，含量具有较大差异，槲皮素3-O-芸香糖苷、甲基槲皮素O-己糖苷、木犀草素O-芥子酰己糖苷、羟甲基黄酮5-O-己糖苷、柚皮素O-丙二酰己糖苷、3,4,5-三羟黄酮O-芸香糖苷、6-C-己糖基-木犀草素O-己糖苷、异牧荆素，在含量分布上的变化趋势最为明显，其含量在S1中远高于S2和S3，被鉴定为S1阶段的特征性物质，这些物质多为黄酮醇和黄酮碳糖苷，它们对S1发育期枣果的紫红色形成可能发挥着重要作用。Beninger等[34]研究发现黄酮醇苷对菜豆种皮呈现紫色和红色具有密切的相关性。Eiro等[35]研究进一步证实黄酮醇多以糖苷态的形式存在，能与花色苷类物质发生辅色作用，对颜色稳定具有重要的作用。 S2的黄酮类化合物显著低于S1和S3，这与S2期果实的所呈现出绿白的颜色较为吻合，含量较高仅有2 种，分别是C-己糖基木犀草素O-己糖苷、6-C-己糖苷-芹菜素O-己糖苷。S3中含量较高的物质为矢车菊素O-己糖基、芹菜素O-己糖基-戊糖苷、槲皮素5-O-己糖苷-O-丙二酰己糖苷、金圣草黄素O-葡萄糖醛酸（水杨醇）醚O-二葡萄糖醛酸、金圣草黄素，这些物质多为糖基化的黄酮，属于黄酮糖苷类化合物中的花色苷类物质，它们对S3时期枣皮呈现出深红色具有重要影响。何丹等[36]在研究紫色西番莲果皮花色苷时指出，花色苷是天然色素的主要成分之一，其可赋予水果、蔬菜和花卉等植物靓丽的蓝色、红色和紫色。因此，本研究发现的上述差异性物质可作为区分枣果皮颜色的潜在标志物，为枣黄酮类化合物与枣果皮颜色的关联研究提供理论基础。

3 结 论

本实验以“三变红”枣果不同发育时期为切入点，研究枣果皮颜色变化和黄酮类化合物的关联，结果发现S1的总黄酮含量略高于S3，但显著高于S2 （P＜0.05），达到4.94 mg/g；而枣果从S1至S3期，颜色经历了从由紫红到绿白再到深红过程，总黄酮含量变化与枣果颜色变化呈现出相同的变化趋势，由此表明枣总黄酮的含量与枣果皮颜色变化表现为明显正相关。利用PCA和OPLS-DA，将S1幼果期、S2白熟期和S3成熟期的黄酮类化合物清晰的HCA，并通过黄酮类化合物差异代谢物筛选出59 个差异代谢物。采用聚类热图分析发现，槲皮素3-O-芸香糖苷、甲基槲皮素O-己糖苷、木犀草素O-芥子酰己糖苷、羟甲基黄酮5-O-己糖苷、柚皮素O-丙二酰己糖苷、3,4,5-三羟黄酮O-芸香糖苷、6-C-己糖基-木犀草素O-己糖苷、异牧荆素含量在S1中远高于S2和S2，被鉴定为S1阶段的特征性枣黄酮类化合物，这些物质多为黄酮醇和黄酮碳糖苷，颜色多为紫色或者红色，为枣皮的紫红色起到较大的贡献作用。S2的黄酮类化合物显著低于S1和S3，这和果实呈现的颜色高度吻合，含量较高仅为C-己糖基木犀草素O-己糖苷、6-C-己糖苷-芹菜素O-己糖苷。S3中含量较高的物质有5 种，分别为矢车菊素O-己糖基、芹菜素O-己糖基-戊糖苷、槲皮素5-O-己糖苷-O-丙二酰己糖苷、金圣草黄素O-葡萄糖醛酸（水杨醇）醚O-二葡萄糖醛酸、金圣草黄素。本研究可更好地理解枣果发育过程中形成颜色的黄酮类化合物累积规律，为枣黄酮的开发利用提供理论依据。