陈 璐，史冬梅，何宏魁，陆 玮，韩兴林,3，孙金沅,

（1.食品质量与安全北京实验室，北京工商大学，北京 100048；2.安徽古井贡酒股份有限公司，安徽 亳州 236000；3.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015）

白酒是中国的国酒，是世界六大蒸馏酒之一，以其独特的香气深受广大消费者的喜爱。随着人们对健康饮食要求的提高，白酒健康逐渐成为研究的焦点之一。中国白酒因原料和酿造工艺的独特性含有较多对人体有益的活性成分，包括含量较高的醇类、酯类等，其在适宜浓度下也对健康有益[1]。除此之外酒中还有一些微量的 生物活性成分，其具有缓解酒精伤害、充分显示人体防御功能、调节生理节奏、预防疾病促进康复等作用[2]。白酒中的活性成分可以分为挥发性和非挥发性成分两类，挥发性活性成分主要以萜烯类、酚类、吡嗪类和含硫化合物为主，非挥发性活性成分主要是氨基酸和生物活性肽等[1]。

前人已对白酒中的挥发性活性成分的功能进行了研究和梳理，有些已经被医药行业广泛应用。范文来等[3]在董酒中发现了41 种挥发性萜烯类化合物；Wang Li等[4]在茅台酒中发现了55 种萜烯类化合物。萜烯类化合物被证明具有抗菌能力[5]、抗病毒能力[6]、抗氧化力、止痛作用、消化活力[7]、防癌抗癌[8-9]等，许多中药材中也含有大量的萜烯类化合物[10]。Fan Wenlai等[11-12]在五粮液和剑南春中检测到了4 种酚类化合物，在洋河大曲中检测到5 种酚类化合物；徐占成等[13]使用全二维-飞行气相色谱-质谱联用检测仪在剑南春中发现了8 种酚类化合物。一部分酚类化合物也具有生物活性，如愈创木酚、苯酚、阿魏酸等。有实验曾研究了酚酸类化合物对UMR106细胞活性的影响，发现7 种酚酸类化合物可同时促进UMR106细胞的增殖与分化[14]。王双[15]在剑南春酒中利用全二维气相色谱-质谱联用仪检测到18 种吡嗪类化合物；Wu Jianfeng等[16]在茅台中发现了8 种吡嗪类化合物。常在酱香型白酒中检出的吡嗪类化合物是呈香物质同时也具有健康功效[1]，例如四甲基吡嗪广泛用于心脏血管和脑血管疾病的治疗，对中枢神经有影响[2]；2-甲基吡嗪具有抗氧化功能[17]。酒中的一些硫醇类化合物在临床上常用某些含有巯基的化合物作重金属的解毒剂[10]。这几类化合物在原酒和商品酒中均有发现。

本实验目的是研究酒醅在蒸馏过程馏分中部分挥发性活性成分的变化。蒸馏是由酒醅得到原酒的重要步骤，酿酒原料中的部分物质和酒醅中的微生物发酵产物在这一步骤中被提取富集，馏分大部分是乙醇和水，亦有大量呈香呈味等微量物质馏出。白酒蒸馏采用分层起窖，分段摘酒，不同层酒醅中微生物发酵产生的物质有不同，不同蒸馏阶段原酒中各类活性成分也有一定差异。采集窖池底层酒醅蒸馏出的原酒为研究对象，探究其中萜烯类、酚类、吡嗪类等活性成分随馏出时间的变化。旨在进一步认识酒醅在蒸馏过程中化学本质上的变化，也可对原酒的分级和后续的贮存勾调等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原酒样品：底层酒醅蒸酒时除弃去的酒头酒尾外每分钟取一次样，共33 个样品，按1～33号排序命名。由安徽古井贡酒股份有限公司提供。

4-乙基愈创木酚、三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪（纯度98%）、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-甲基苯酚（纯度99%）、2,4-二叔丁基苯酚（纯度99.5%）、2-乙基吡嗪（98%）、香兰素（纯度99%）（均为色谱纯） 北京百灵威公司；亚油酸乙酯（纯度97%）、β-石竹烯（纯度90%） 东京化成工业株式会社公司；二甲基三硫（纯度98%） 美国TCI公司；2-乙烷-3,5-二甲基吡嗪（纯度99%） 上海麦克林生化科技有限公司；无水硫酸钠（120 ℃烘箱中烘烤5 h）、氯化钠、二氯甲烷（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975A气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纤维头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

DB-FFAP型毛细管柱（60 m×250 µm，0.25 µm）；载气为He，流速为1 mL/min；不分流模式，进样量1 µL，平衡时间1 min，进样口温度250 ℃；柱子流速1 mL/min；升温程序：起始温度40 ℃，保持0 min；以5 ℃/min升温至90 ℃，恒温0 min；再以1 ℃/min升温至94 ℃，保持0.5 min；然后以3 ℃/min升温至205 ℃，保持2 min；然后以5 ℃/min升温至250 ℃，保持3 min。

1.3.2 质谱条件

电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；传输线温度250 ℃。定时质谱检测器，在6.3 min状态为关闭，7.8 min时打开。定性采用全扫描模式，质量扫描范围45.00～350.00 u，驻留时间0.2 s。定量采用选择离子扫描模式。

1.3.3 固相微萃取

通过单因素试验对固相微萃取实验条件进行优化。考察萃取纤维种类（75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、萃取温度（30、40、50、60 ℃）和萃取时间（30、40、50、60 min）。

为进行优化实验，配制标准溶液所含化合物为二甲基三硫、β-石竹烯、香叶基丙酮、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、二苯并呋喃和亚油酸乙酯，均为酒样中常见的挥发性活性成分。

优化后实验条件为50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头提取白酒中的挥发性成分。取2 mL酒样加入7 mL饱和氯化钠溶液，使所有酒样乙醇体积分数稀释到15%以下后，转移至20 mL顶空瓶中，加盖封口于50 ℃平衡15 min，萃取50 min，插入250 ℃气相色谱进样口，解吸5 min。

1.3.4 涡旋辅助液液微萃取

通过单因素试验对涡旋辅助液液微萃取实验条件进行优化，考察涡旋时间（30 s、1 min、2 min）和离心时间（5、7、10 min）。优化后实验条件：取一定量模拟酒样或酒样于50 mL离心管中，加入50 µL质量浓度为100 mg/L的2-乙酰基吡嗪作为内标，加入适量的超纯水将酒样乙醇体积分数稀释到15%以下，加适量氯化钠至过饱和，涡旋混合，加入2 mL二氯甲烷，涡旋萃取1 min，8 000 r/min离心5 min，收集下层有机相。重复3 次，合并萃取液氮吹至0.5 mL，进行气相色谱-质谱分析。

1.4 数据处理

白酒微量成分的定量数据、标准曲线以及定量方法的检出限、定量限、精确度和回收率等采用Microsoft Office Excel 2019进行计算；相关图形采用Origin 8.5.1软件绘制；主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析采用SPSS 19.0软件分析。

2 结果与分析

2.1 固相微萃取法和涡旋辅助液液微萃取法对比

分别采用固相微萃取和涡旋辅助液液微萃取对1号酒样进行分析，因主要关注酒醅蒸馏过程中部分健康活性成分的变化，故分析中只列出酚类、萜烯类、吡嗪类和呋喃类的具体检出情况，对酯类、醇类、酸类、醛酮类和其他类的化合物作大致介绍。

通过固相微萃取并结合气相色谱-质谱共检测到87 种化合物，包括49 种酯类、5 种醇类、5 种酸类、8 种醛酮类、7 种酚类、4 种萜烯类、3 种呋喃类和6 种其他类化合物。通过涡旋辅助液液微萃取法结合气相色谱-质谱共检测到120 种化合物，包括39 种酯类、15 种醇类、11 种酸类、14 种醛酮类、9 种酚类、3 种萜烯类、7 种吡嗪类、13 种呋喃类以及9 种其他类化合物。涡旋辅助液液微萃取对酒中微量化合物的萃取数量和种类更多，选择性更低。并且对于本实验关注的酚类、萜烯类和吡嗪类的富集率更高。相较于其他常用的前处理方法如液液萃取、溶剂辅助蒸馏萃取、同时蒸馏萃取等，涡旋辅助液液微萃取需要的有机溶剂更少，操作更简便。由此得出涡旋辅助液液微萃取更适合原酒中挥发性活性成分变化的研究。

2.2 酒醅蒸馏过程中挥发性活性成分的变化规律

蒸馏是白酒生产工艺中重要的环节之一，通过甑的传热与传质可以将酒醅中的乙醇、水和微量成分富集到原酒中。白酒中的微量成分由于挥发性和水溶性的不同，导致其在蒸馏过程中的馏出时间不同。采用涡旋辅助液液微萃取对所采集的酒醅蒸馏过程中不同时间段馏分酒样进行前处理，结合气相色谱-质谱定量分析。探索在摘酒时间范围内随着蒸馏时间的延长，酒中部分挥发性活性成分的变化趋势。

2.2.1 乙醇体积分数的变化

图1 蒸馏过程中各馏分乙醇体积分数变化Fig. 1 Change in alcohol content in fermented grains during distillation

蒸酒过程是动态变化的过程，酒醅蒸馏出的原酒中占比最高的是乙醇和水，同时含量较少的挥发性活性成分、呈香物质等微生物发酵产物也由于不同的水溶性在不同的蒸馏时间被浓缩提取到原酒中，研究乙醇体积分数的变化可侧面评价微量成分在蒸馏过程的变化规律。由图1可知，馏出原酒的乙醇体积分数随蒸馏时间的延长呈下降趋势。酒样中乙醇体积分数最大为70%，最小为45%。

2.2.2 蒸馏过程中活性挥发成分的含量变化

结合涡旋辅助液液微萃取对原酒的定性结果和文献中前人对化合物活性的研究，实验选取18 种化合物为目标化合物，分别为2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、 4-乙基愈创木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、香兰素、二甲基三硫、β-石竹烯、亚油酸乙酯和3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛。二甲基三硫是古井贡酒中重要的挥发性功能成分，二甲基三硫具有抗氧化、抑制血小板、降低血糖等作用[10]。β-石竹烯是从白酒中检出的一种萜烯类化合物，具有抗病毒、抗炎症等活性，还具有体外抗肿瘤细胞的活性[10]。亚油酸乙酯在人体内可水解产生高级脂肪酸亚油酸[18]，它不能由人体自身合成，是一种需要从食物中摄取的必需脂肪酸。亚油酸的代谢产物γ-亚油酸具有提高免疫力[19]、抑制癌细胞生长[20]、降血脂[21]、减肥[22]等功效。3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛是合成治疗风湿性关节炎和骨关节炎的药物Darbufelone[23-24]的重要原料。

测量实验方法的回收率及检出限和定量限，并绘制化合物的定量曲线，结果如表1所示。采用定量曲线计算不同摘酒时间馏分中挥发性活性成分的含量，结果如表2所示。

表1 涡旋辅助液液微萃取方法验证及化合物定量曲线Table 1 Verification of VA-LLME and quantitative calibration curves of volatile bioactive compounds

图2 第33分钟馏分中部分挥发性活性成分Fig. 2 Contents of selected volatile bioactive ingredients in the distillation fraction at 33 minutes

表2 不同蒸馏时间馏分中挥发性活性成分的含量Table 2 Contents of volatile bioactive components in Baijiu at different distillation times

为了对目标化合物的含量进行大致比较，选取第33分钟馏出的原酒数据进行分析。由图2可知，所测酒样中，亚油酸乙酯含量较高，在蒸馏过程中亚油酸乙酯在原酒中的质量浓度达到了2 820.27～8 009.90 µg/L， 它与棕榈酸乙酯和油酸乙酯被称为白酒中的三大高级脂肪酸。在蒸馏过程初期质量浓度最大，之后降到4 097.74 µg/L，从第6分钟左右开始上下浮动但变化不明显，第32～33分钟时质量浓度下降到2 820.27 µg/L。亚油酸乙酯不溶于水，而溶于乙醇，故在蒸馏初段质量浓度偏高，最后质量浓度迅速下降可能是由于酒醅中的亚油酸乙酯前期已被大量蒸出。

图3 8 种酚类化合物在不同蒸馏时间馏出原酒中的含量变化Fig. 3 Changes in concentrations of 8 phenolic compounds in fractions with distillation time

除亚油酸乙酯外，酚类化合物含量相较其他类化合物偏高。4-甲基苯酚、4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚是原酒中主要的酚类，它们在底层酒醅中的质量浓度达到315.46～2 151.08、109.89～1 676.37 µg/L和63.21～986.85 µg/L。由图3可知，8 种酚类化合物除 2,4-二叔丁基苯酚外的馏出规律相同，随着蒸馏过程浓度逐渐上升，且上升速率相似，说明化合物的馏出规律与化合物的结构有很大的相关性。酚类化合物含有羟基，具有较强的亲水性。由于蒸馏过程中乙醇体积分数不断降低，含水量相对上升，因此酚类化合物随着蒸馏时间的延长呈现上升趋势[25]。

2,4-二叔丁基苯酚与其他7 种酚类化合物的馏出规律不同，其含量在整个采样时间中趋于稳定，但在第20分钟左右出现波动，可能与生产工艺有关。相对于目标化合物中的其他酚类物质，2,4-二叔丁基苯酚在支链上的2 个疏水基团叔丁基使它的亲水性大大降低，平衡了酚羟基的亲水性导致它在蒸馏过程中含量保持稳定。

实验共定量分析6 种吡嗪类化合物，分别为2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪。其含量相比馏分中其他种类化合物含量稍低。关注的吡嗪类化合物中含量最高的是三甲基吡嗪，质量浓度范围为59.06～877.75 µg/L。由图4可以看出，6 种吡嗪的馏出规律相同，都是随蒸馏的进行馏分中的含量增加。吡嗪类化合物既能溶于水也可以溶于乙醇，它们的变化规律和疏水性关系不大。含量增加的主要的原因是蒸馏过程中发生美拉德反应的产物中含有吡嗪类化合物。蒸馏过程不仅是单纯的富集过程，还有一些化学反应发生，在蒸馏时糖和氨基酸发生的美拉德反应就是其中之一[26]。美拉德反应会生成吡嗪类化合物[27]，导致蒸馏馏分中含量增加。葛向阳[28]与司冠儒[29]等也研究了吡嗪类在白酒蒸馏过程中的变化规律，结果均表明吡嗪类化合物在白酒蒸馏过程中呈上升趋势。

图4 吡嗪类化合物在不同蒸馏时间馏出原酒中的含量变化Fig. 4 Changes in contents of pyrazines in base Baiju at different distillation times

图5 2 种其他化合物的馏出规律Fig. 5 Distillation patterns of two other compounds

由图5可以看出，二甲基三硫含量总体随着蒸馏时间的延长先增加后减少，但其在第19分钟时含量突然降低，同时3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛的含量在第18分钟增加约3 倍后又趋于稳定。2 种化合物含量的变化可能是采集样品时的错误或与生产工艺有关，还需要后续的研究。

2.2.3 数据分析

由表3 可知，前6 个P C 的累计贡献率能够达到98.173%，前2 个PC的累计贡献率已经达到83.492%，足以说明随着蒸馏时间的延长化合物含量的变化。对PC1贡献较大的化合物为三甲基吡嗪、4-甲基苯酚、四甲基吡嗪、香兰素、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪；对PC2贡献较大的化合物为亚油酸乙酯和3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛。

表3 PC的特征值和贡献率Table 3 Characteristic values and contribution rates to total variance of PC

图6 18 种化合物的载荷图（A）和33 个样品的PCA图（B）Fig. 6 Loading plot of 18 compounds (A) and PCA of 33 samples (B)

使用数据分析软件对实验数据进行降维处理。由 图6A可以看出，18 个化合物中只有β-石竹烯在第3象限；3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚和亚油酸乙酯在第2象限，可以看出2,4-二叔丁基苯酚和其他研究的酚类馏出规律不同，且因为2 个叔丁基的存在使它和3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛的馏出规律更为相近；其他吡嗪类、酚类化合物和二甲基三硫在第4象限，但二甲基三硫和其他化合物相距较远，二者的馏出规律也并不相同。吡嗪类和酚类在图6B中较为紧凑，它们的馏出规律也较为相似。PCA验证了前文分析结果的准确性，能更加直观说明活性成分的馏出规律和它的结构密不可分。 从图6B可以看出，1～5号样品受PC2的影响较大，5～32号样品受PC1的影响较大，32号样品与33号样品受PC2的影响较大。随着蒸馏时间的延长，相邻样品间存在着规律性变化，相邻馏出时间的样品在图6B中也相近。

如图7所示，整体上看，33 种酒样可以分为两大类，从第23分钟分开，除酒头酒尾外的接酒中段可以分为前段、后段两部分。而前段又从第17分钟分为2 类，1～16 min为1 类，17～22 min为第2类。后段大致从第29分钟分开，23～28 min为1 类，29～33 min为1 类，但第26分钟所接酒样属于后一类。这样酒样被细分为4 类，大致符合接酒时间规律。可以看出33 种酒样随着蒸馏时间的变化酒体也发生了细微的变化，但综合33 种酒样PCA的结果，此变化不足以将酒样进行等级上的划分，但可以为分段摘酒作参考。

图7 33 个酒样的聚类分析Fig. 7 Cluster analysis dendrogram of 33 Baijiu samples

3 结 论

分别使用固相微萃取和涡旋辅助液液微萃取对蒸出原酒进行定性分析，固相微萃取定性出87 种化合物，其中包括7 种酚类和4 种萜烯类化合物；涡旋辅助液液微萃取定性出120 种化合物，包括9 种酚类、3 种萜烯类和7 种吡嗪类化合物。可知涡旋辅助液液微萃取相对于固相微萃取更适合分析酒醅蒸馏馏分中的挥发性活性成分。

在后续实验中定量分析了在目标蒸馏时间33 min内每分钟馏出原酒中的18 种挥发性活性化合物：2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、愈创木酚、 4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、香兰素、二甲基三硫、β-石竹烯、亚油酸乙酯和3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛。使用涡旋辅助液液微萃取检测到的挥发性活性成分中，吡嗪类和大部分酚类在不同馏分中的含量会随着蒸馏时间的延长而增加，亚油酸乙酯的含量随蒸馏时间延长呈下降趋势，二甲基三硫和3,5-二叔丁基-4-羟基苯甲醛含量在蒸馏过程中的变化趋势不明显。

实验结果证明活性成分的馏出规律与挥发性和疏水性有关，不同化合物结构导致不同的馏出规律，吡嗪类化合物还可能在蒸馏过程中作为美拉德反应的产物生成。通过研究酒醅蒸酒过程中部分挥发性活性成分的馏出规律，加深了对挥发性活性成分的研究，发现了它们在蒸馏过程的馏出规律，可以对白酒生产企业的蒸馏和勾调过程进行指导，有利于强化白酒中的活性成分。