黄钦钦，田亚平

（江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

糖尿病是一组以高血糖为特征的非传染性慢性疾病，一般将空腹血糖大于7.0 mmol/L或餐后血糖大于11.1 mmol/L认定为糖尿病[1]。糖尿病常伴有糖尿病肾病（肾衰）、眼病（失明）、足病（截肢）、败血症等并发症，几乎危害到身体的每个部分，是致残致死的“头号杀手”[2-4]。II型糖尿病是糖尿病的主要类型，占糖尿病发病率的90%～95%[5]。II型糖尿病主要表现为胰岛素抵抗或者是β细胞功能受损[6]。

α-葡萄糖苷酶被认为是控制II型糖尿病的有效靶点，α-葡萄糖苷酶抑制剂通过可逆性占据α-葡萄糖苷酶的催化位点，延缓多糖向可吸收的单糖的转化，改善餐后高血糖的出现，使患者的血糖保持平稳，预防治疗II型糖尿病[7]。 同时，二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV，DPPIV）也可作为治疗II型糖尿病的重要靶点[8]。胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）是一种经食物刺激后由肠L细胞分泌，并能刺激胰岛素分泌的激素[9]。GLP-1以葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛素的分泌，降低胰高血糖素的分泌，从而降低血糖。然而，GLP-1的半衰期极其短暂仅2 min，易被人体内的DPP-IV 降解[10]。通过开发DPP-IV抑制剂，抑制DPP-IV的活性，避免GLP-1被其降解而失活，使GLP-1发挥作用，维持糖尿病患者血糖稳定。

条斑紫菜为海洋藻类，属红藻门、原红藻纲、红毛菜科、紫菜属[11]。紫菜蛋白多肽具有降血压[12]、抗氧化[13]、 降血脂[14]、抗凝血[15]、抑菌[16]等多种生理活性。有关紫菜蛋白降血糖活性的研究，Admassu等[17]发现紫菜酶解多肽体外具有α-淀粉酶抑制活性，电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（electrospray ionization-quadrupole-time of flightmass spectrometry，ESI-Q-TOF-MS）鉴定新型肽为Gly-Gly-Ser-Lys和Glu-Leu-Ser。冯学珍等[18]研究发现食用海藻（海带、裙带菜、紫菜）具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。然而，有关紫菜蛋白酶解液α-葡萄糖苷酶、DPP-IV双酶抑制活性尚鲜有报道。

本实验室前期通过酶解条斑紫菜证明其蛋白酶解液具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性[19-20]。在此基础上，通过进一步研究发现条斑紫菜酶解多肽溶液同时具备DPP-IV 抑制活性。本研究对条斑紫菜α-葡萄糖苷酶、DPP-IV双酶抑制活性肽进行分离纯化，对抑制活性高的成分进行鉴定及活性表征，以期为紫菜资源深度开发高附加值医药中间体提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

条斑紫菜 南通千鹤食品有限公司；α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（p-nitrophenyl α-Dglucopyranoside，pNPG） 上海源叶生物科技有限公司； DPP-IV、甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺 美国Sigma公司；Diprotin A（Ile-Pro-Ile） 英国Abcam公司； 中性蛋白酶、碱性蛋白酶 青岛吉宝生物科技有限 公司；BCA试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司； 氨肽酶 本实验室制备。

1.2 仪器与设备

UF101超滤纳滤装置 上海弗立特实业有限公司；ÄKTA avant蛋白纯化系统 美国GE公司；多功能酶标仪 铂金埃尔默有限公司；真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；UH5300双光束紫外分光光度计、高速低温离心机 日本日立集团。

1.3 方法

1.3.1 条斑紫菜蛋白酶解液的制备

条斑紫菜酶解多肽制备参照周锋[19]、胡春芹[20]等方法稍作修改。以中性蛋白酶（酶底比为8×104U/g）、碱性蛋白酶（酶底比为8×104U/g）、氨肽酶（酶底比为28 U/g）在温度50 ℃、pH 8.5条件下复配酶解紫菜蛋白6 h，沸水浴灭酶20 min。酶解上清液经10 kDa膜进行超滤除去多糖等杂质，透过液再经1 000 Da膜进行纳滤，得到1 000 Da以下粗肽液。

1.3.2 粗肽液稳定性表征

1.3.2.1 pH值稳定性

每管取1 mg/mL多肽溶液10 mL，将pH值分别调至3、4、5、6、7、8、9、10，室温下放置2 h后，测定其 α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性。α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性保持率按式（1）计算：

式中：A1为处理前抑制率；A2为经不同pH值处理后抑制率。

1.3.2.2 温度稳定性

每管取1 mg/mL多肽溶液10 mL，置于100 ℃的沸水浴中，恒温1、2、3、4、5 h后，取出冷却至室温，测定其α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性。按式（1）计算α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性保持率。

1.3.2.3 体外模拟胃肠消化

用2 mol/L的HCl溶液将条斑紫菜多肽溶液pH值调至2.0，放入37 ℃水浴中孵育15 min，按酶与底物比1∶40加入胃蛋白酶。避光于37 ℃、130 r/min恒温孵育70 min（此转速模拟体内胃蠕动）。用2 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH 6.8终止胃蛋白酶反应。将胃蛋白酶消化阶段混合液37 ℃预热15 min，按酶与底物比1∶40加入胰蛋白酶，充分溶解，避光于37 ℃、45 r/min恒温孵育120 min，反应结束后，将反应液加热至100 ℃持续20 min终止酶反应。为明确消化过程对多肽样品抑制活性的影响，分别测定胃蛋白酶、胰蛋白酶消化体系对 α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性。

1.3.3 Sephadex G-10凝胶过滤层析

将溶胀好的Sephadex G-1 0 介质填充成14 mm×600 mm的层析柱，用去离子水进行平衡。粗肽液经0.22 μm滤膜除去杂质，样品进样量为1 mL，洗脱剂为去离子水，洗脱流速1 mL/min，在220 nm波长下进行检测。收集各洗脱峰，冷冻干燥，分别配制成0.5 mg/mL的溶液，测定其对α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制活性。

1.3.4 超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）-ESI-Q-TOF-MS分析

将凝胶过滤层析得到的抑制活性最强的峰收集浓缩，利用UPLC-ESI-Q-TOF-MS鉴定纯化肽的氨基酸序列和分子质量大小。色谱条件：BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流动相A：0.1%甲酸；流动相B：0.1%甲酸-乙腈；流速0.3 mL/min；上样量5 μL；柱温45 ℃；检测波长220 nm。质谱条件：正离子模式电喷雾；母离子质量范围m/z 50～2 000；碰撞能量6 eV。使用MassLynx V4.1软件进行氨基酸序列分析。

1.3.5 合成肽双酶抑制活性表征

经MaxEnt3和PepSep分析鉴定得到的肽序委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，纯度99.69%，验证其α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制活性。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

采用pNPG法，参照Lordan等[21]方法并稍作修改。用20 mmol/L、pH 6.8的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）将α-葡萄糖苷酶与pNPG分别配制成200 U/mL 和10 mmol/L的溶液。移取100 μL样品溶液和50 μL α-葡萄糖苷酶溶液于96 孔微量滴定板中，在37 ℃水浴保温10 min，再加入50 μL的pNPG溶液37 ℃条件下充分反应1 h，最后加入50 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液终止反应。酶标仪405 nm波长处测定吸光度。实验设置样品组、样品空白组、对照组、空白组。采用阿卡波糖为阳性对照，与紫菜酶解多肽对α-葡萄糖苷酶的抑制效果作对比。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（2）计算：

式中：Ac为对照组吸光度，PBS＋酶＋pNPG＋Na2CO3；Ab为空白组吸光度，PBS＋PBS＋pNPG＋Na2CO3；As为样品组吸光度，多肽＋酶＋pNPG＋Na2CO3；An为样品空白组吸光度，多肽＋PBS＋PBS＋Na2CO3。

1.3.7 DPP-IV抑制活性的测定

通过底物发色法，参照Wang Rongchun等[22]方法稍有改良。用100 mmol/L、pH 8.0的Tris-His缓冲液将DPP-IV 与甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺分别配制成0.02 U/mL和2.5 mmol/L的溶液。25 μL样品溶液与25 μL甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺溶液37 ℃反应10 min，再加入50 μL DPP-IV溶液37 ℃充分反应1 h。最后，加入100 μL的乙酸钠缓冲液（1 mol/L，pH 4.0）终止反应。在酶标仪405 nm波长处反应溶液的吸光度。以Diprotin A作为阳性对照，计算如式（3）所示：

式中：Ac为对照组吸光度，Tris-His缓冲液＋甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺溶液＋DPP-IV＋乙酸钠缓冲液；Ab为空白组吸光度，Tris-His缓冲液＋甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺溶液＋Tris-His缓冲液＋乙酸钠缓冲液；As为样品组吸光度，多肽＋甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺溶液＋DPPIV＋乙酸钠缓冲液；An为样品空白组吸光度，多肽＋Tris-His缓冲液＋Tris-His缓冲液＋乙酸钠缓冲液。

1.3.8 多肽分子质量分布测定

参照Li Tingting等[23]方法进行测定。

1.3.9 多肽质量浓度测定

采用BCA试剂盒法测定多肽质量浓度，按照说明书进行操作，以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，曲线测定范围为25～2 500 μg/mL。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 条斑紫菜酶解多肽双酶抑制活性分析

图1 条斑紫菜酶解多肽分子质量分布（a）和相对含量（b）Fig. 1 Molecular mass distribution (a) and relative contents (b) of peptides from enzymatic hydrolysis of Porphyra yezoensis

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是糖代谢途径中的关键酶，调控碳水化合物降解为单糖的反应[24]。α-葡萄糖苷酶抑制剂和α-淀粉酶抑制剂可以延缓多糖向单糖的转化。DPP-IV抑制剂通过抑制DPP-IV对GLP-1的降解，提高餐后胰岛素水平。通过测定条斑紫菜酶解多肽对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及DPP-IV的抑制活性，评价其体外降血糖功效。

如图1所示，条斑紫菜经中性蛋白酶、碱性蛋白酶、氨肽酶复配酶解后主要为1 000 Da以下小分子多肽，占97.10%。其中，180～500 Da多肽相对含量最高为51.32%，＜180 Da次之。说明紫菜蛋白经酶解得到的主要为二肽到五肽等小分子活性肽。酶解液经10 kDa超滤膜除去多糖等杂质后，再经1 000 Da膜进行纳滤收集透过液，如表1所示，1 000 Da以下粗肽液对α-葡萄糖苷酶的IC50值19.83 μg/mL低于阳性对照阿卡波糖的IC50值35.65 μg/mL，对DPP-IV的IC50值517.04 μg/mL高于阳性对照Diprotin A的IC50值69.67 μg/mL，说明粗肽液双酶活性中糖苷酶抑制活性表现更突出，这种分子质量范围较小的天然原料酶解肽往往还具备胃肠耐受性好、吸收快的特点，未来食品工业使用天然产物来源的抑制剂是一种必然的发展趋势[25]。

表1 粗肽液体外抑制活性Table 1 In vitro inhibitory activities of crude peptide solution against α-glucosidase and DPP-IV

目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂的天然来源主要是植物和微生物两类[26]。冯学珍等[18]通过萃取获得的紫菜乙酸乙酯提取部位具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其IC50为7.89 mg/mL。Nguyen等[27]发现类芽孢杆菌TKU042的次级代谢产物高龙胆酸对α-葡萄糖苷酶的IC50为0.22 mg/mL。 近年来研究显示，除了骆驼乳[28]、马乳清蛋白[29]等乳蛋白酶解产物具有DPP-IV抑制活性外，小麦[30]、大豆[31]等 植物蛋白也是DPP-IV抑制肽的重要来源。关于紫菜蛋白作为DPP-IV抑制肽却尚未有研究。Wang Feng等[32]证实了燕麦谷蛋白、青稞谷蛋白、荞麦谷蛋白对DPP-IV的IC50值分别为840、850、980 μg/mL，其抑制效果弱于紫菜酶解多肽。

2.2 粗肽液稳定性表征

2.2.1 pH值、温度稳定性

如图2a所示，条斑紫菜酶解多肽具有较宽的pH值耐受范围。在pH 3～10范围内，条斑紫菜酶解多肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性保持率达98%以上；DPP-IV抑制活性保持率在pH 3～8范围内逐渐上升且总体抑制活性保持率高于96%，pH 8.0以上时开始逐渐降低。因此，紫菜多肽在应用于生产时应注意其pH值环境，尽量避免置于强碱环境下。

图2 粗肽液对两种酶的pH值（a）、温度（b）稳定性Fig. 2 Effect of pH (a) and temperature (b) on the inhibitory activity of crude peptide solution against α-glucosidase and DPP-IV

通过前期实验发现，温度100 ℃以下对抑制活性没有影响。本研究控制恒定温度100 ℃，探究不同的孵育时间对两种酶抑制活性的影响。结果表明，条斑紫菜酶解多肽经100 ℃处理5 h后对α-葡萄糖苷酶抑制活性无影响，DPP-IV抑制活性在处理3 h后才显著下降（图2b）。粗肽液具有良好的耐热性，高温对其2 种酶的抑制活性影响都较小，后期加工过程中可以采用100 ℃、20 min煮沸灭菌。

2.2.2 体外模拟胃肠消化

图3 粗肽液对两种酶的胃肠消化稳定性Fig. 3 Effect of gastrointestinal digestion on inhibitory activity of crude peptide solution against α-glucosidase and DPP-IV

粗肽液经胃消化阶段后，其α-葡萄糖苷酶抑制活性稳定不变，再经十二指肠环境下胰蛋白酶作用后抑制率升高了30.48%；DPP-IV抑制率在胃消化和肠消化阶段都有一定的提高，分别上升了15.38%、39.23% （图3）。天然的活性肽是否能作为降血糖药物的代替品，需确定多肽经口腔、胃进入肠道后活性是否发生改变。实验结果表明，条斑紫菜酶解多肽进入酸性很强的胃部环境和复杂的肠道环境后抑制活性都呈上升趋势，证明消化过程对两种酶抑制活性有促进作用。在消化过程中，多肽体系中仍有部分肽链经胃蛋白酶、胰蛋白酶作用发生断裂[33]。

2.3 凝胶过滤层析分离

基于粗肽液较高的双酶抑制活性，良好的pH值、温度和胃肠消化稳定性，对粗肽液进行进一步分离纯化，解析其多肽氨基酸组成。凝胶过滤层析是按分子质量大小进行分离的，Sephadex G-10交联度高、网孔小，分级范围小于700 Da[34]。如图4a所示，纳滤后的条斑紫菜酶解液经Sephadex G-10凝胶过滤层析纯化后，有2 个活性峰，分别为峰1和峰2。对峰1、峰2进行多次收集，冷冻干燥，备用。如图4b所示，多肽质量浓度为 0.5 mg/mL时，峰1对α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制率分别为71.24%、35.73%，峰2对α-葡萄糖苷酶、DPP-IV的抑制率分别为93.15%、69.53%。峰2组分对两种酶的抑制活性均强于峰1，说明后出峰的小分子肽发挥更显著的双酶抑制活性。收集峰2组分，冷冻干燥，备用。

图4 Sephadex G-10凝胶层析图谱（a）及各个峰的抑制活性（b）Fig. 4 Sephadex G-10 gel chromatogram (a) and inhibitory activity of each fraction (b) against α-glucosidase and DPP-IV

2.4 UPLC-ESI-Q-TOF-MS鉴定分析

对2.3节中活性峰2进行UPLC-MS分析鉴定。如图5所示，0～4 min为溶剂峰，样品峰主要集中在4～25 min。根据各峰的分离效果和响应值大小，利用MassLynx V4.1软件进行分析，发现保留时间为5.28 min和14.84 min处的洗脱峰在220 nm波长处具有较强的紫外吸收。5.28 min和14.84 min处2 个洗脱峰峰形左右对称，响应值高，纯化效果好，可能为主要的活性物质[35]。如图6所示，5.28 min和14.84 min处2 个信号峰的分子离子峰[M＋H]＋分别为m/z188、329，计算其分子质量分别为187、328 Da。经MaxEnt3和PepSep分析确定其氨基酸组成分别为Ala-Pro（图6a）、Pro-Gly-Gly-Val（图6b）。这与报道的DPP-IV抑制肽大多为二肽到五肽相符合，且大多数DPP-IV抑制肽结构中含有Ala和Pro，一般N端的第一或第二个氨基酸为Pro或Ala[36]。

图5 活性峰2的UPLC图Fig. 5 UPLC of fraction 2

图6 Ala-Pro（a）和Pro-Gly-Gly-Val（b）二级质谱图Fig. 6 Tandem mass spectra of Ala-Pro (a) and Pro-Gly-Gly-Val (b)

2.5 合成肽的活性表征

本实验室前期研究发现[19]，条斑紫菜蛋白酶解液经分离纯化得到的三肽Ala-Ala-Ala对α-葡萄糖苷酶有显著抑制作用（IC50=97.36 μg/mL）。对新型肽Ala-Pro、Pro-Gly-Gly-Val进行合成，纯度为99.69%。对合成肽的α-葡萄糖苷酶和DPP-IV抑制活性分别进行表征，如表2所示，Ala-Pro对DPP-IV表现出较强的抑制活性，其IC50为4.65 mmol/L，对α-葡萄糖苷酶无抑制活性；Pro-Gly-Gly-Val具有α-葡萄糖苷酶和DPP-IV双酶抑制活性，IC50分别为18.60 mmol/L和17.80 mmol/L。

表2 合成肽的双酶抑制活性表征Table 2 Characterization of double-enzyme inhibitory activities of synthetic peptides

3 结论与讨论

本研究以条斑紫菜为原料酶解制备α-葡萄糖苷酶、DPP-IV双酶抑制活性肽。条斑紫菜蛋白酶解液经超滤、纳滤得到的1 000 Da以下小分子多肽液对α-葡萄糖苷酶和DPP-IV的IC50值分别为19.83、517.04 μg/mL，且pH值、温度及胃肠消化稳定性强。经Sephadex G-10凝胶过滤层析、UPLC-ESI-Q-TOF-MS纯化分析，由MassLynx V4.1软件对二级质谱中的特征碎片峰进行鉴定得到新型肽Ala-Pro、Pro-Gly-Gly-Val。通过表征其α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性发现，Ala-Pro具有单独的DPP-IV抑制活性，Pro-Gly-Gly-Val具有双酶抑制活性。

由2～4 个氨基酸结合形成的小肽具有特别的小肽吸收机制，Smith等[37]首次提出并证实了小肽可被完整的吸收。纯化得到的α-葡萄糖苷酶、DPP-IV双酶抑制活性肽均为短肽，更有利于人体的消化吸收，可发展成为潜在的口服降血糖多肽产品。

紫菜蛋白经酶解产生的多肽片段数目和种类较多，粗肽液表现出较强的双酶抑制活性。进一步分离纯化后，单一成分纯度提高，α-葡萄糖苷酶、DPP-IV抑制活性提高不明显。由此推测，除肽解析过程中存在遗漏外，不同结构的抑制肽之间可能存在协同或者联合抑制作用[38-39]。新型肽的抑制机理及协同抑制作用有待进一步研究。