黄俊逸，王凤娜，吴 香，刘 珊，李 聪，李新福，徐宝才,3,

（1.上海大学生命科学学院，食品营养与功能实验室，上海 200444；2.江苏雨润肉食品有限公司，肉品加工与质量控制国家重点实验室，江苏 南京 211806；3.合肥工业大学食品科学与工程学院，安徽 合肥 230036）

发酵香肠是指将绞碎的瘦肉同切丁脂肪粒混合，辅以糖类、食用盐和各种香辛料等灌入肠衣，经微生物发酵、成熟干燥而形成的具有稳定微生物特性和典型发酵香味的一种发酵肉制品[1-2]。发酵香肠种类丰富，按国别划分，有黎巴嫩大香肠、德国的Teewurst香肠、西班牙的Charqui香肠、意大利的萨拉米香肠和我国的腊肠等[3-4]。该类产品营养丰富，易消化，具有独特的发酵风味，深受世界各地人们的喜爱[5]。

在香肠发酵至成熟的过程中，微生物的作用对产品品质具有重要影响[6]，优良的发酵菌种能更好地提升香肠的品质。乳酸菌在发酵香肠的生产中具有降解糖类物质、促进产品发色和提高产品的安全性等作用[7-9]。其中，嗜酸乳杆菌是动物（包括人体）肠道内的优势菌群之一，能降低胆固醇、抗肿瘤和改善肠道功能紊乱等。Arihara等[10]首次将嗜酸乳杆菌应用于发酵肉制品，获得了健康的香肠产品。Gilliland等[11]指出嗜酸乳杆菌能将胆固醇同化到自身细胞膜中，进而降低产品中胆固醇含量，对人体具有一定的保健功能。其次，肉糖葡萄球菌能分泌脂肪酶和蛋白酶，会促进肉制品中脂质降解、风味氨基酸和芳香酯的形成[12-13]。Montel[14]和Beck[15]等也指出肉糖葡萄球菌能降解香肠的蛋白质和脂肪，提升其营养价值。汪淼等[16]发现肉糖葡萄球菌具有高产硝酸盐还原酶特性，可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐，赋予肉制品特有的色泽。

为改善发酵香肠在自然条件下生产的品质不稳定、生产易受环境制约且生产周期长等缺点[17]，文献[18]利用纯乳酸杆菌成功发酵制作成了干香肠。自此，人工制备发酵剂并应用于肉制品生产得到了广泛的关注。根据发酵剂微生物的种类，发酵剂可分为复配发酵剂和单一发酵剂。复配发酵剂相比于单一菌种制备的产品更能发挥各菌种的优势，从而改善或提升产品品质。张开屏等[19]将嗜酸乳杆菌和木糖葡萄球菌混合接种至发酵香肠，能迅速产酸降低香肠pH值至5.3以下，水分活度下降速率较对照组稍快，结果发现复配发酵剂有效地提升了香肠的安全性。

目前将嗜酸乳杆菌或肉糖葡萄球菌单一应用于发酵香肠中的研究较多，但是将两者复配成复合发酵剂，并应用于提升发酵肉制品品质的研究鲜见报道。根据前期实验的基础，嗜酸乳杆菌有良好的产酸能力，肉糖葡萄球菌有优良的蛋白酶和脂肪酶活性，本实验将嗜酸乳杆菌和肉糖葡萄球菌以不同的接种量进行复配，通过对发酵香肠生产过程中的pH值、水分活度、质构、色泽和感官评价的综合评定，探讨不同复配发酵剂对香肠品质的影响，优选出一种能有效提升香肠品质发酵剂，以期为我国发酵香肠的生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉糖葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）分离自金华火腿，由扬州大学微生物实验室提供；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus） 中国工业微生物菌种保藏管理中心；商业化发酵剂（戊糖片球菌和木糖葡萄 球菌） 马鞍山雨润百瑞食品有限公司；猪肉、牛肉、 背膘 江苏雨润肉食品有限公司。

食盐 南京盐业公司；黑胡椒粉、茴香籽粉、 大蒜粉 安徽名珍食品有限公司；食用葡萄糖 山东 西王糖业有限公司；香精 马鞍山雨润百瑞食品有限公司；MRS肉汤、MRS培养基、脑心浸出液肉汤（brain heart infusion，BHI）、金葡菌甘露醇氯化钠琼脂（mannitol salt agar，MSA）培养基 北京陆桥生物技术有限责任公司；亚硝酸钠、D-异抗坏血酸钠、氯化钾（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CTHI-250B型恒温恒湿箱、MJ-78A型高压蒸汽 灭菌锅 施都凯仪器设备（上海）有限公司；3K15型台式冷冻离心机 德国Sigma公司；HN-08型无菌均质器 上海汗诺仪器有限公司；U5100型紫外分光 光度计 日本日立公司；VS-1300L-U型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；IS-RSD3型恒温振荡器 HRYSTAL公司；G560E型自动旋涡仪 美国Asientific Industries公司；CM-14型斩拌机 荥阳市成远食品机械厂；MB-22S型台式绞肉机 北京南常肉食机械有限公司；ST100A型切片机 广州安狮贸易有限 公司；VF-620型真空灌肠机 德国汉德曼公司；JA12002型电子天平 上海菁海仪器有限公司；FE38酸度计 梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；HD-4型智能型水分活度测量仪 无锡市华科仪器仪表有限公司；CR-400型色差计 日本Konica Minolta Sensing公司；TA.XT. Plus型质构仪 英国Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物发酵剂制备

嗜酸乳杆菌采用MRS肉汤活化：在保存的斜面平板上挑取单菌落接种至装有10 mL的MRS肉汤试管中，37 ℃厌氧培养24 h。肉糖葡萄球菌采用BHI活化：在该菌的斜面平板上挑取单菌落接种至装有10 mL的BHI肉汤试管中，32 ℃恒温摇床培养，转速150 r/min，培养时间24 h。活化好的2 种菌再进行扩大培养，培养至2 种菌的对数生长期的末期或稳定期时，将菌液置于4 ℃离心机内，以6 000 r/min离心5 min，弃上清液，菌体同样条件洗脱后，添加适量无菌生理盐水稀释，测定菌液OD600nm值。

菌体密度标准曲线的绘制：将收集的菌体分别稀释至不同浓度测定OD值，同时菌落平板计数，将所得的菌落总数与OD值对应绘制成标准曲线。扩大培养后的菌体通过OD值代入标准曲线得出对应的菌落总数，用无菌生理盐水将上述2 种菌液浓度分别调至109～1010CFU/mL，置于4 ℃冰箱待用。

1.3.2 工艺流程及操作要点

原料肉解冻→预斩→猪瘦肉、牛肉、脊背膘绞制（粒径3 mm孔板）→拌匀辅料→添加微生物发酵剂→灌肠→回温→发酵→热加工→冷却→风干熟化→成品。

原料肉解冻：4 ℃解冻，解冻结束时，肉块中心温度小于0 ℃；原料肉绞制：将质量比为6.5∶3∶0.5的猪瘦肉、脊背膘、牛肉混合后置于绞肉机内绞碎。

辅料配方（质量分数）：食用盐（2.4%）、亚硝酸钠（0.010%～0.015%）、D-异抗坏血酸钠（0.075%～0.080%）、食用葡萄糖（0.85%）、香辛料（黑胡椒粉、茴香籽粉和大蒜粉）适量。

微生物发酵剂：以1 kg肉样混合物按表1菌种配比及接种量添加相应的量；商业组发酵剂由戊糖片球菌和木糖葡萄球菌组成。

回温：灌肠后置于室温下1～3 h，待表面无水分残留时放入发酵箱中发酵。发酵条件：（35±1）℃，24～28 h；热加工处理：加热使肠体中心温度达到60～70 ℃时即止，用时约15～30 min；风干熟化：将肠体置于10～15 ℃空间，保持相对湿度在75%～90%之间，待肠体失水率大于35%时，发酵香肠制作工艺结束。最后对各个香肠样品进行取样分析。

1.3.3 pH值测定

根据GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》的方法，称取10.0 g样品，加入0.1 mol/L的氯化钾溶液100 mL，用均质器进行均质，过滤后用pH计测定浸出液的pH值。

1.3.4 水分活度的测定

根据GB 5009.238—2016《食品水分活度的测定》（第二法），分别称取1.00 g样品置于水分活度仪中，迅速封闭测量仓，10 min后记录测量值。

1.3.5 色差测定

采用D65光源，用标准板进行校正后，利用色差计测定样品切片的L*值（亮度值）、a*值（红度值）、b*值（黄度值），平行测定6 次，计算其平均值。另外，参照张聪[20]的方法引入a*/b*比值，作为评定香肠色差变化的重要参数之一。

1.3.6 质构测定

采用质地剖面分析法（texture profile analysis，TPA）剥去香肠肠衣，肠体切段成直径20 mm，高15 mm的块状，放入质构仪上测定TPA。测定参数的设置：P/50A探头，测前速度2 mm/s，测中速度2 mm/s，测后速度5 mm/s，测试间隔时间5 s，压缩比50 %，触发力5 g，每个样品测试6 次，取其平均值。

1.3.7 挥发性风味化合物测定

先用固相微萃取法提取样品中的挥发性化合物，再通过气相色谱-质谱分析测定。即称取5 g各样品，绞碎后装入萃取瓶中，采用顶空固相微萃取法，提取风味成分。萃取头涂层厚度为75 μm，复合式Car/PDM，萃取温度为60 ℃，萃取时间为45 min。

气谱条件：以He为载气，色谱毛细管柱为PEG-20M柱（柱长30 cm，内径0.25 mm，液膜厚度0.25 µm），不分流，流速为1.0 mL/min，进口温度为250 ℃。色谱柱的升温程序为：载气为He，流速0.8 mL/min，不分流；起始温度50 ℃，保持3 min，以3 ℃/min的速率升温到140 ℃，然后以5 ℃/min的速率升温到200 ℃，保持3 min；汽化室温度230 ℃。

质谱条件：离子源温度和接口温度分别为230 ℃和150 ℃，质谱扫描范围：m/z33～450，电子能为70 eV，离子化方式为电子电离源，发射电流为200 μA，检测电压为350 V。

1.3.8 感官评价

选择10 位专业人士对发酵香肠进行感官评价。采用九点快感标度法，1=极端厌恶；2=非常厌恶；3=一般厌恶；4=稍微厌恶；5=既不喜欢也不厌恶；6=稍微喜欢；7=一般喜欢；8=非常喜欢；9=极端喜欢，分别对香肠的色泽、质地、滋味、气味、总体接受度进行评定。将发酵香肠去除外衣，切成2～3 mm的薄片，然后在感官评价室进行评价。评价过程中要去除外界干扰，参与人士之间不得进行交流。当品评完一个样品后，用清水漱口，再进行下一个样品的评价。将分数汇总，计算平均值和误差值，分析其质量。

1.4 数据处理与统计分析

通过Microsoft Excel 2010建立数据库，用Origin 8软件作图，采用SPSS 17.0统计软件进行测定指标的方差分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同发酵剂组合对发酵香肠pH值的影响

由图1可知，在样品灌肠时各组起始pH值均在5.90左右。发酵1 d后，添加复合发酵剂组的pH值均迅速下降至5.0以下。这是因为发酵剂中的乳酸菌快速繁殖，分解碳水化合物，产生乳酸、乙酸等有机酸而导致产品pH值急剧下降[9,21]，这与Essid等[22]的研究结果一致。但因为复合发酵剂比例不同，其pH值降低程度也有一定的差异。研究表明，发酵期间香肠的pH值降低至4.8～5.0时对抑制有害微生物的效果较好，且能改善产品色泽和风味[23]。A1、A2和A3组pH值刚好在此范围内。商业组和B组pH值均低于4.8，且B组的pH值更低。自然组pH值在1～5 d内与发酵前相比均无显著变化（P＞0.05），这可能是因为自然组没有加入乳酸菌，仅靠原料肉自带的乳酸菌且数量较少而无法在发酵初始阶段快速降低产品的pH值。

随着发酵时间的延长，复合发酵剂组和商业组的pH值均有一定程度的缓慢回升现象，这可能与其中的蛋白酶作用有关，蛋白质被分解产生胺、氨和游离氨基酸等碱性物质，从而使其pH值上升[24]。自然组在发酵过程中pH值有一定的下降趋势，但仍然维持在5.4以上，这可能是随着生产时间延长，肠体自带的乳酸菌逐渐生长繁殖，使产品pH值下降。加工过程中，添加复合发酵剂组的pH值始终显著低于自然组（P＜0.05），说明发酵剂可加速香肠的产酸过程，加快其生产周期，提升产品品质和安全性。

根据美国GMP指南对发酵香肠的发酵温度和发酵时间的规定，发酵香肠pH值需要在1 d内达到5.3以下[25]，根据本实验结果，除自然组不符合生产要求外，添加复合发酵剂的香肠均符合生产要求。

2.2 不同发酵剂组合对发酵香肠水分活度的影响

图2 不同发酵剂组合对发酵香肠水分活度的影响Fig. 2 Effect of different starter cultures on Aw of fermented sausages

由图2可以看出，在灌肠时各组水分活度值均在0.945左右。发酵1 d后，添加发酵剂香肠的水分活度值有略微上升，此时环境发酵相对湿度较高为95%。这可能是因为加入的乳酸菌在适宜温湿度下发酵产酸，使蛋白质降解导致其保水能力下降，产品中游离水增加[25]从而增加了香肠的水分活度值[26]。随着生产时间的延长，各组水分活度均呈显著下降趋势（P＜0.05）。可见，不同接种量的复合发酵剂对发酵香肠生产期间的水分活度具有一定影响。在发酵成熟期间，复合发酵剂组的水分活度均低于自然组，水分活度值依次为自然组（0.782±0.003）＞ A 组（0.6 9 0±0.0 0 5 ～0.7 1 0±0.0 0 1）＞ B组（0.580±0.005～0.605±0.002），且差异显著 （P＜0.05），说明添加发酵剂能加速香肠水分活度值下降，菌种接种量越大，下降速度越快，水分活度值越低。在成熟后期，B1、B2、B3组的水分活度值显著低于A1、A2、A3组和商业组，但商业组与A组差异不显著 （P＞0.05）。添加发酵剂组的水分活度值均显著低于自然组，说明所添加的复配发酵剂能加速产品水分活度值的降低，保证其安全性。

2.3 不同发酵剂组合对发酵香肠色泽的影响

图3 不同发酵剂组合对发酵香肠L*值的影响Fig. 3 Effect of different starter cultures on L* value of fermented sausage

图4 不同发酵剂组合对发酵香肠a*/b*值的影响Fig. 4 Effect of different starter cultures on a*/b* ratio of fermented sausage

由图3可以看出，发酵期间各组L*值（亮度值）明显下降，发酵1 d后，各组L*值差异不显著。在后期发酵成熟过程中，商业组和添加发酵剂组的L*值显著低于自然组，这可能是因为香肠中的水分含量随着风干成熟时间的延长而逐渐减少，香肠在后期色泽变深，从而使L*值缓慢降低，成熟结束时，自然组的L*值显著大于添加发酵剂组（P＜0.05）。

由于在评价香肠的色泽时，单纯的a*值不能完全反映人肉眼观察的直观感受，而b*值不同会影响最终结果。所以在实际应用中，a*/b*值能更准确地反映人体肉眼观察结果。在一定程度上，a*/b*值越大，产品红色越鲜艳[25-27]。由图4可知，与生产初期相比，添加发酵剂组发酵1 d后的a*/b*值迅速上升，显著大于自然组 （P＜0.05），说明添加发酵剂可以促进香肠发色，而自然组则没有类似的呈色现象。研究结果表明，不同复配发酵剂对香肠成熟期间发色有显著影响。成熟结束后，B1、B2和B3组的a*/b*值显著大于其他组（P＜0.05），但是色泽较为暗红，不利于被消费者接受。A组和商业组呈现鲜艳的红色，色泽优于其他组，而A3组的a*/b*值显著大于A1、A2，更接近商业组，这可能是因为一定数量的葡萄球菌对发色有促进作用，肉糖葡萄球菌能还原硝酸盐产生NO，NO能与肌红蛋白结合为亚硝基肌红蛋白，且能产生过氧化氢酶来消除过氧化氢，稳定色泽，还能减少肉制品中生物胺的含量[28-29]。

2.4 不同发酵剂组合对发酵香肠质构的影响

表2 不同发酵剂组合对发酵香肠质构的影响（n=6）Table 2 Effect of different starter cultures on TPA properties of fermented sausage (n= 6)

由表2可知，添加发酵剂组的硬度显著高于自然组（P＜0.05），其中，B1、B2和B3组的硬度显著高于其他组，其原因可能跟香肠发酵过程中嗜酸乳杆菌和肉汤葡萄球菌的作用，水分活度显著下降且肠体处于较低的酸性环境中，导致蛋白质变性及酸诱导的凝胶作用使香肠的组织结构变得更为紧密，从而使香肠的硬度增大[29-30]。

在弹性方面，A1、A2、A3组的弹性略优于其他组，且显著高于自然对照组（P＜0.05）。在黏聚性方面，除B1、B2与自然组无显著差异外，其余各组的黏聚性均显著高于自然组（P＜0.05），A3组的黏聚性较高且优于商业组。咀嚼性是硬度、弹性和黏聚性的乘积，添加发酵剂组的咀嚼性显著大于自然组（P＜0.05）。结果表明，添加发酵剂的香肠比自然发酵的香肠具有更高的硬度、弹性、黏聚性和咀嚼性。其中，A1、A2、A3组和商业组具有适中的咀嚼性，而A3组发酵剂生产的产品具有较好的黏聚性、弹性、咀嚼性和硬度，和商业组间无显著性差别。可见发酵剂对改善香肠的品质具有重要作用。

2.5 不同发酵剂组合对发酵香肠挥发性风味物质的影响

表3 不同发酵剂组合对发酵香肠挥发性风味物质种类数的影响Table 3 Effect of different starter cultures on volatile flavor compounds of fermented sausages

各组发酵香肠检测到的挥发性风味物质成分见 表3，8 个实验组共检测出164 种挥发性风味物质，主要包括烃类50 种，醛类22 种，酸类12 种，醇类25 种，酮类11 种，酯类23 种，醚类3 种，酚类3 种，还有含氮化合物、含硫化合物、呋喃等其他类化合物15 种。总体来看，烃类化合物在各组中的种类含量最多。不同处理组之间的风味物质种类存在差异，添加发酵剂组的风味物质种类显著多于对照组，其中复合发酵剂组的醛类、酸类、醇类、酯类的种类显著多于自然发酵的香肠，对照组共检测出42 种风味化合物，而添加发酵剂的各组均有50 种以上的风味物质，这可能是加入的微生物通过代谢产生的酶类促进了香肠中脂肪、蛋白质、糖类等这些成分分解，其中由脂肪分解成的游离脂肪酸和蛋白质分解成的游离氨基酸是重要的风味前体物质，能够有效促进风味的形成。

表4分析了不同发酵剂组合的发酵香肠中酯类风味物质种类和含量的变化。酯类物质是发酵香肠特殊风味形成的必要物质，其中乙酯类物质可以赋予香肠果香和奶油香味，是香肠风味形成的重要物质[31-32]。 酯类的形成通常需要一个复杂的反应链，在复合发酵剂作用下醇类和酸类发生酯化反应，酯类物质可赋予发酵香肠典型风味。酯类物质相对含量最高的是 A1（18.34%）、A2（18.94%）、B3（19.14%），之后依次是自然组（10.19%）、B1（8.54%）、A3（5.48%）、B2（1.64%），相对含量最低的为商业组（1.40%）。这可能是由于肠体中微生物和复合发酵剂利用肉中的脂肪和蛋白质，加快酸类和醇类物质的产生，且经过一系列反应形成了具有特殊香气的酯类物质。自然和商业组酯类物质单一，复合发酵剂组的酯类物质种类较多，其中含量较高。由于复合发酵剂的加入，发酵香肠产生了自然组和商业组中没有的酯类物质，且种类较多，如正己酸乙酯、庚酸乙酯、异戊酸乙酯、乳酸乙酯，其中正己酸乙酯具有浓郁的酒香气，庚酸乙酯和异戊酸乙酯呈果香和酸甜气味，乳酸乙酯具有朗姆酒、水果和奶油的香气。

表4 不同发酵剂组合生产的发酵香肠酯类物质含量变化Table 4 Effect of different starter cultures on ester contents in fermented sausages

2.6 不同发酵剂组合对发酵香肠感官评价的影响

表5 不同发酵剂组合对发酵香肠感官评分的影响Table 5 Effect of different starter cultures on sensory evaluation of fermented sausages

表5是不同复合发酵剂对香肠的感官评分结果。对比各组香肠的色泽评分，A2、A3和商业组的色泽得分较高，其中，A3和商业组高于其他组。从质地来看，A1、A2、A3和商业组的得分较高，表明这4 组皆有良好的组织结构。从滋味来看，A2、A3组高于其他组。A1、A2、A3和商业组的风味得分较高，但是差异性不显著。对比各组香肠的总体接受程度，A1、A2、A3和商业组的得分较高，其中A3组的得分最高，与其他组有显著差异。

综合上述结果，不同复合发酵剂对各组香肠的色泽、质地、滋味和风味具有一定的影响，添加复合发酵剂的香肠优于自然发酵香肠。各组产品的感官评分显示，A3组相较于其余实验组具有更好的色泽、滋味、总体接受度，该组复合发酵剂更适合产品的生产与推广。

3 结 论

本研究发现与自然发酵香肠相比，嗜酸乳杆菌和肉糖葡萄球菌复配组与商业组均能在发酵期间快速降低香肠的pH值，接种量越大，pH值和水分活度越低，在生产终点时均具有较低的水分活度。香肠pH值和水分活度在生产过程中的变化是保证其安全性和品质稳定性的重要栅栏因子，在香肠发酵期间，由于香肠具有较高的水分活度，pH值的快速降低是保证其发酵期间安全性的重要因素；成熟后期，由于pH值的缓慢回升，水分活度的降低对抑制香肠中腐败微生物的生长具有重要贡献，较低的pH值和水分活度对其质构特性具有一定影响。

相对于自然组及商业组，A3组具有较高的a*/b*值，色泽较鲜艳。具有适中的硬度、弹性、黏聚性和咀嚼性，质构特性更好。感官的评分结果表明，A3组的色泽、滋味、总体接受度的得分最高，也具有较高的质地和风味评分。因此采用接种量为107CFU/g，嗜酸乳杆菌和肉糖葡萄球菌配比为1∶3时，所生产出来的香肠产品的品质最优。