李荣源，卢红梅，秦 兴，陈 莉，汪 沙，吴 震

（贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

食醋作为常用的调味品和食品保藏剂，在中国具有悠久的发展历史。早在2 500多年前就有食醋被用于调味和疾病治疗的记载[1]。明朝时期，李时珍在《本草纲目》中就有记载：“醋能消肿、散火气、杀邪毒、理诸药之功效”[2]。现代医学研究表明食醋具有降血压、降血脂、抗疲劳、抗菌杀菌、调节血糖、抗氧化等功效[3-5]。

赤水晒醋是贵州省赤水市生产的一种具有典型地方特色的优质食醋产品，由多种中药材制作成药曲和大米、糯米、麸皮发酵生产而成。其生产过程主要分为4 个阶段：采药制曲阶段、乙醇发酵阶段、醋酸发酵阶段和醋醅曝晒阶段。赤水晒醋最显著的特点便是“晒”，独特的醋醅曝晒阶段可以促进醋液中风味物质积累，其次是以药制曲的工艺，在制曲过程中加入108 种[6]中草药粉成分，使晒醋不但具有很高的食用价值，还兼有一定的药用作用。晒醋中检测出的2,4,5,6-四甲基吡嗪（川芎嗪，挥发性成分相对含量的6.00%）的含量较高，使得晒醋具有一定的保健功效[7]。晒醋醋曲的制作是在自然条件下进行的，包含了各种微生物的生长，由于中草药本身具有抑菌、抗氧化等生物活性，既能保持赤水晒醋的独特风味，防止产生异味，又可以促进霉菌等的生长，提高醋曲的品质，从而形成赤水晒醋独具特色的风味特征。

现代生物技术的高速发展带来了高通量测序[8-9]和变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10-12]等技术在食醋发酵中微生物群落测定的应用，以至于有越来越多对发酵食品的微生物组成、发酵过程中的变化以及功能的研究。Solieri等[13]研究意大利传统香醋的酵母菌群落，发现大部分菌株属于Zygosaccharomyces属，其中，Z. bailii的丰度占41%。Ilabaca等[14]研究智利传统食醋发酵过程中微生物变化，发现食醋在发酵末期仅存的醋酸菌为Acetobacterpasteurianus。Wu Jiajia等[15]研究食醋固态发酵过程中醋酸菌的多样性，结果表明，醋酸菌主要是A. pasteurianus。本研究将通过高通量测序方法分析检测各阶段样品及药曲中细菌和真菌的种类和含量，结合微生物群落结构变化研究赤水晒醋发酵过程中物质含量变化的深层原因，对进一步了解赤水晒醋工艺和认识赤水晒醋具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

药曲制备样品：随机选取3 个将用于生产的曲块，取3 个样品（YQ-1、YQ-2、YQ-3）进行分析。

乙醇发酵样品：选取上述3 个曲块所属的乙醇发酵结束的发酵缸，取3 个样品（JJFJ-1、JJFJ-2、JJFJ-3）进行分析。

醋酸发酵样品：选取上述3 个发酵缸所属的醋酸发酵结束的发酵槽，木槽四周和中间等量醋醅混匀，取3 个样品（CSFJ-1、CSFJ-2、CSFJ-3）进行分析。

曝晒醋醅样品：选取同属一个醋酸发酵槽的3 个曝晒3 a的曝晒坛，晒坛上部、中部、下部各不同位置等量醋醅混匀，取3 个样品（SCP-1、SCP-2、SCP-3）进行分析。

DNA抽提试剂盒 美国Omega BioTek公司；2%琼脂糖凝胶 法国Biowest公司；FastPfuPolymerase 北京TransGen公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美国Axygen公司；Fast DNA SPIN Kit for Soil 美国MP Biomedicals公司。

1.2 仪器与设备

N13462C移液器、5430 R小型离心机、5424R高速台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；ABSON MiFly-6小型离心机 合肥艾本森科学仪器有限公司； NanoDrop2000超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C电泳仪 北京市六一仪器厂；GeneAmp®9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国ABI公司；MiSeq测序仪、HiSeq测序仪 美国Illumina公司；ELx800酶标仪 美国BioTek公司；TBS380微型荧光计 美国Turner BioSystems公司；Covaris M220 Gene有限公司； QL-901旋涡混合器 海门其林贝尔仪器制造有限公司；TL-48R粉碎研磨仪 上海万柏生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

参考文献[16]方法。2 g醋醅样品，20 mL磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4，pH 7.0）悬浮，加0.5 g玻璃珠，涡旋仪最大涡旋速度充分涡旋5 min。4 ℃、200×g离心5 min，收集上清液，将沉淀用PBS洗涤2 次并收集上清液。将所有上清液4 ℃、10 000×g离心10 min弃去上清液，收集沉淀。收集的沉淀用1 mL PBS重悬，转入1.5 mL的EP管 中，-20 ℃冻存备用。

1.3.2 DNA提取

使用DNA抽提试剂盒提取醋醅或醋液内含物微生物DNA。所有样品的DNA提取步骤均参照DNA抽提试剂盒说明书，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取质量。

1.3.3 PCR扩增及测序

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物338F/806R、ITS1F/ITS2R（上海美吉生物公司），利用引物扩增出特异性序列，具体引物见表1。

表1 PCR引物Table 1 Sequences of primers used for PCR

细菌PCR体系：20 μL rTaqDNA聚合酶，2 μL 10×Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物各0.8 μL，0.2 μLTaq酶，0.2 μL牛血清蛋白，10 ng模板DNA，20 μL ddH2O；反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 次循环；72 ℃延伸10 min。

真菌PCR体系：20 μLTransStart FastPfuDNA聚合酶，4 μL 5×FastPfuBuffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，牛血清蛋白0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O 20 μL；反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27 次循环；72 ℃延伸10 min。

根据PCR扩增产物浓度进行等浓度混样，使用2%琼脂糖凝胶电泳检测效果。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，纯化后的样品使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建库试剂盒进行文库构建，构建测序文库后在MiSeq平台进行高通量测序。

1.4 数据处理

MiSeq测序得到双端序列数据，根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接（merge）成一条序列，对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，得到优化数据。使用FLASH、Trimmomatic以以下标准进行数据优化：1）过滤reads尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的reads，去除含N碱基的reads；2）根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接（merge）成一条序列，最小overlap长度为10 bp；3）拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛选不符合序列；4）根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。得到最终优化数据。

将最终优化数据在97%相似度水平下进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类分析，根据聚类分析结果：1）进行α多样性分析，其中菌群丰度可由ACE指数进行评估，其数值越高表明群落物种丰富度越高；菌群多样性由Shannon指数、Simpson指数进行评估，Shannon指数与群落多样性呈正相关，Simpson指数呈负相关。覆盖率是测序深度指标。2）分别绘制样品各分类学水平下的群落结构图、Venn图、Heatmap热图、β分析图、主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）图。

2 结果与分析

2.1 α多样性分析

根据97%相似性水平下的OTU信息，采用α多样性指标的ACE指数、Shannon指数及Simpson指数对样品微生物物种丰富度和多样性进行评估，结果见表2。所有样品的OTU覆盖率为99.93%～99.99%，表明样品中的微生物种类几乎都被检测到。稀释曲线主要利用各样本测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，从而反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当稀释曲线趋向于平缓时表明测序数据量较为合理。基于97%相似度的OTU水平制作的细菌和真菌的稀释曲线如图1所示，曲线平缓，说明测序深度较好，测序数据量合理。

表2 α多样性分析Table 2 Microbial α-diversity indices of samples

图1 基于97%相似度OTU高通量测序的稀释曲线Fig. 1 Rarefaction curves based on OTUs with 97% similarity obtained by Illumina MiSeq sequencing

2.2 微生物的组成分析

图2 样品中细菌在目水平上的物种相对丰度Fig. 2 Relative abundances of the major bacterial orders in samples

图3 样品中真菌在目水平上的物种相对丰度Fig. 3 Relative abundances of the major fungal orders in samples

由图2、3 可得，在目水平上，各个阶段的微生物结构差异明显，乙醇和醋酸发酵阶段的微生物结构有一定的延续性。药曲阶段，链霉菌亚目（Streptomycetales）、芽孢杆菌目（Bacillales）和乳酸杆菌目（Lactobacillales）是细菌优势菌目，占细菌总量的80%～98%，散囊菌目（Eurotiales）（96.7%～99.3%）是真菌优势菌目，且能看出各个样品间的差异较大，说明每个晒坛内部都具有独特的微生物结构。乙醇发酵阶段，乳酸杆菌目（86.7%～97.3%）是细菌优势菌目，有少量红螺菌目（Rhodospirillales）、梭菌目（Clostridiales）和芽孢杆菌目，散囊菌目（89.3%～95.3%）是真菌优势菌目，还有少量的丝孢酵母目（Trichosporonales）、酵母目（Saccharomycetales）（0.4%～8.7%）。醋酸发酵阶段，乳酸杆菌目（60.4%～81.6%）和红螺菌目（16.3%～32.4%）是细菌优势菌目，有少量芽孢杆菌目（1.5%～6.5%），散囊菌目（65.5%～84.5%）是真菌优势菌目，酵母目（5.6%～8.7%）的比例则在醋酸发酵阶段上升。醋醅曝晒阶段，红螺菌目（6.8%～34.3%）、芽孢杆菌目（5.5%～67.6%）、棒杆菌目（Corynebacteriales）（4.6%～17.8%）、伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）（2.0%～12.9%）、假单胞菌目（Pseudomonadales）（0.5%～9.1%）和乳酸杆菌目（0.8%～12.1%）等细菌均有发现，散囊菌目（2.7%～3 4.4%）、煤炱目（Capnodiales）（4.0%～28.3%）、格孢腔菌目（Pleosporales）（1.0%～33.9%）和酵母目（1.0%～6.2%）等真菌也被发现。

表3 各样品在属水平的优势菌种Table 3 Dominant bacterial and fungal strains in samples at the genus level

表4 样品在属水平共有微生物种类数的统计Table 4 Number of bacterial and fungal species common to samples at the genus level

图4 样品中细菌在属水平上的物种相对丰度Fig. 4 Relative abundances of the major bacterial genera in samples

图5 样品中真菌在属水平上的物种相对丰度Fig. 5 Relative abundances of the major fungal genera in samples

由表3、4可知，18 种细菌和16 种真菌在每个阶段都有发现，且在乙醇发酵、醋酸发酵和曝晒阶段共有的真菌、细菌相对较多，在曝晒阶段独有的细菌种类数达到205 种，真菌种类数达到69 种，各个阶段的共有真菌、细菌种类数也体现出了菌群的延续性。由图4、5 可知，细菌的芽孢杆菌属（Bacillus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）和真菌的曲霉属（Aspergillus）、嗜热真菌属（Thermomyces）都有较大相对丰度，这些菌属在药曲的生长代谢中会产生各种发酵所需的酶和氨基酸，如芽孢杆菌属能产蛋白酶、α-淀粉酶和L-酪氨酸等物质[17-18]，高温放线菌属能分泌具有耐高温性质的α-淀粉酶、TVA I和TVAII[19-20]，曲霉属可代谢产生大量高活性的蛋白酶及糖化酶[21-22]且部分菌种能转化甾类、生物碱类和吩嗪类化合物等[23]，嗜热真菌能够生产β-1,4-内切木聚糖酶，该酶能以内切方式作用于木聚糖主链，产生不同链长的寡糖和少量的木糖[24]。这些菌种在发酵过程对分解淀粉、蛋白质等物质有重要作用。

药曲阶段，部分样品中链霉菌属（Streptomyces）有较大的相对丰度，能分泌抗生素类物质抑制其他菌种的生长，代谢生产抗肿瘤物质[25]，还有糖单孢菌属（Saccharomonospora）、糖多孢菌属（Saccharopolypora）、丝孢酵母菌属（Trichosporon）等能分泌多种物质，如糖多孢菌属能产生丝氨酸蛋白酶、纤维素降解促进因子等[26]，丝孢酵母菌属能分泌β-葡萄糖苷酶，该酶属于纤维素酶，能提高挥发性香气成分的含量，可提升食醋的风味[27]。

乙醇发酵阶段，曲霉属、嗜热真菌属和丝孢酵母菌属是真菌优势属，乳杆菌属是乙醇发酵中唯一优势细菌菌属，分析原因是由于发酵缸除表层外都处于无氧环境，较适宜乳杆菌属的生长，此外，醋酸单胞菌属（Acetobacter）和葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）在乙醇发酵醪液中都被检出。据报道，黄曲霉（Aspergillusflavus）等丝状真菌可利用木糖生产乙醇[28]，Clostridium属细菌能利用纤维素、半纤维素或五碳糖生产乙醇[29-30]，这些菌在样品中的相对丰度达到1.0%～6.3%和0.3%～6.4%，且各个阶段都有检出。乙醇发酵阶段是多边发酵过程，醋酸菌和产膜酵母的代谢会消耗乙醇，且其他物质也会在该阶段积累，如有机酸、氨基酸等，造成了发酵醪液中乙醇含量低，酸度高。乙醇含量呈先增后降，酸度呈持续上升的趋势。乳杆菌属是乙醇发酵中唯一优势细菌菌属，也使得晒醋制备中不挥发酸比例较高，保证赤水晒醋独特的风味品质。

醋酸发酵阶段，醋酸单胞菌属的相对丰度明显增加，达到16.1%～31.6%，葡糖醋杆菌属也有增加，说明醋酸代谢较旺盛，由于乙醇发酵阶段乳杆菌属的大量存在，所以乳酸菌在醋酸发酵阶段仍占细菌的主体。醋醅曝晒过程中，微生物的种类大大增加，如红球菌属（Rhodococcus）、枝孢属（Cladosporium）、梗孢酵母属（Sterigmatomyces）、枝顶孢属（Acremonium）等，这些微生物促进了曝晒醋醅中各种物质的积累，提升赤水晒醋的品质，如红球菌属菌可以生产亮氨酸、苯丙氨酸和类胡萝卜素[31-32]，枝孢属可以产纤维素酶[33-34]，枝顶孢属菌可以分泌酚类、萜类、环肽、蒽酮类等物质[35]，梗孢酵母属能够产生各种细胞色素且是豆酱的主要功能微生物[36-37]。

Heatmap用颜色变化反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地以颜色深浅定义数值的大小，常通过颜色的梯度及相似程度反映数据的相似性和差异性。由图6a可得，在细菌属水平，乙醇和醋酸发酵的聚类分析结果最为接近，表示这6 个样品所含细菌种类及其丰度相似，主要是由于2 个阶段的发酵环境具有延续性且相似。与之较接近的是醋醅曝晒阶段，分析是因为细菌主要来源于醋酸发酵醋醅，在曝晒中因环境的改变而形成独特的细菌结构，但仍有一定的连续性。药曲中形成了独特的细菌结构，这是不同的发酵环境所致。SCP-1与YQ-2被分为同一类，具体分析可以看出，SCP-1的细菌种类明显高于YQ-2，其原因是二者的链霉菌属、芽孢杆菌属和高温放线菌属的丰度较为接近。由图6b可得，样品真菌属与细菌属水平的聚类分类结果相似。乙醇和醋酸发酵被分在一个大类，药曲则因其优势菌属嗜热真菌属和曲霉属的丰度等级与之相似，也被分为一个大类，同样的也有SCP-2。嗜热真菌属丰度等级较高的JJFJ-1、JJFJ-2、 JJFJ-3和YQ-2、YQ-3分为一个小类，曲霉属丰度等级较高的CSFJ-1、CSFJ-2、CSFJ-3和YQ-1被分为另一个小类。曝晒醋醅的真菌种类明显比其他样品丰富，因此，曝晒醋醅被独立分为一类。

图6 样品物种相对丰度排名前30的属及在每个样品中的丰度聚类热图Fig. 6 Heat map analysis of top 30 most abundant genera in samples

2.3 β多样性分析

图7 样品的层级聚类分析Fig. 7 Hierarchical clustering analysis of microbial community structure in samples using weighted UniFrac distance algorithm

β多样性表示不同群落间物种组成变化，即“与环境梯度或环境格局相关的群落组成变化幅度或群落分化程度”[38]。本研究使用weighted UniFrac距离算法分析赤水晒醋发酵各阶段的微生物多样性。由图7a可得，考虑到样本间的细菌种类和丰度因素，乙醇和醋酸发酵阶段各自为一个小类，然后聚为一个大类，表现出这2 个阶段的延续性和与其他阶段的不同。SCP-2、SCP-3和YQ-1、YQ-3同样各自为一个小类，然后聚成一个大类。但SCP-1和YQ-2被分为了一类，这一分类结果同样是由于二者的链霉菌属、芽孢杆菌属和高温放线菌属的丰度较为接近。但由β多样性可以看出，曝晒醋醅和药曲细菌多样性存在相似，与乙醇和醋酸发酵样品有明显差异，推测是由于两者相似的固态、高温和低含氧量的发酵环境。图7b中将乙醇发酵和药曲样品分为一类，然后与醋酸发酵和SCP-2分为一个大类，SCP-1和SCP-3则分为一类，说明药曲和乙醇发酵的真菌多样性相似，而SCP-2与SCP-1、SCP-3的相似性较低。

PCoA是一种非约束性的数据降维分析方法，使用PCoA图可展示各样品间微生物群落结构的差异。从 图8a可得，PCoA1的贡献率为64.59%，可知乙醇和醋酸发酵的细菌微生物结构相似，药曲和曝晒醋醅的细菌微生物结构相似，但样品之间差异性较大，尤其是YQ-2和SCP-1与其他同一阶段样品距离较远。图8b则显示，药曲、乙醇和醋酸发酵样品的真菌微生物结构相似，与曝晒醋醅样品有明显区别，并且曝晒醋醅样品之间也有较大差异。这符合聚类分析结果，但PCoA可清晰反映曝晒醋醅样品之间微生物结构的较大差异，分析是因为醋醅分装在晒场的曝晒坛内，无论是装坛以前的微生物结构，还是曝晒环境都存在区别，导致曝晒醋醅样品之间的微生物结构有明显差异。

图8 样品中细菌和真菌群落的PCoAFig. 8 PCoA of bacterial and fungal communities present in samples

3 结 论

本研究采用高通量测序检测赤水晒醋各生产阶段微生物群落结构，结合丰度聚类热图和β多样性分析表明。对于细菌，乙醇发酵和醋酸发酵相似度最高。对于真菌，药曲制备、乙醇发酵和醋酸发酵的微生物结构相似度较高，醋醅曝晒阶段的微生物结构则有明显差异。发现从药曲、乙醇发酵、醋酸发酵至醋醅曝晒都有微生物的传承，但每个阶段存在环境和条件的差异，使微生物结构不断变化，尤其是在醋醅曝晒阶段各个样品之间的差异更为明显。通过微生物结构分析，在乙醇发酵和醋酸发酵阶段都是乳杆菌属、醋杆菌属和曲霉属、嗜热真菌属、丝孢酵母属占绝对优势菌属，起到了主导作用，这两个阶段是赤水晒醋中主要物质积累的过程，生产大量的有机酸、氨基酸等物质。在醋酸发酵和醋醅曝晒阶段，酵母菌的活性并没有受到抑制，共检出了梗孢酵母属、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）、红酵母属（Rhodotorula）和丝孢酵母菌属等非酿酒酵母，并且在部分样品中有较高的相对丰度，它们能够产生包括萜类化合物、酯类、高级醇、丙三醇、乙醛、乙酸和琥珀酸的风味化合物，增加了赤水晒醋中风味成分的种类和含量。而醋醅曝晒阶段微生物结构则不同于其他阶段，无论是细菌还是真菌都没有绝对优势菌种存在，同时也是微生物种类最多的阶段，有194 种真菌和400 种细菌被检测到。因此，在这一重要阶段会代谢生产大量营养物质，从而形成赤水晒醋独具特色的风味品质。