简 燕，李小波，王 博，赵 静，索海翠，黄安平，胡柏耿，曹春梅，张勇飞,*

（1.湖南省农业科学院农业生物技术研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院农业环境生态研究所，湖南 长沙 410125；3.广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室，广东 广州 510640；4.武汉基诺赛克科技有限公司，湖北 武汉 430070；5.北京诺禾致源科技有限公司，天津 301700；6.国家马铃薯工程技术研究中心，山东 乐陵 253600；7.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

1991年国际植物新品种保护联盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）提出作物品种实质派生现象的认定标准、鉴定技术和该类品种附加的责任和义务。这些标准、责任、义务保护了育种者的权益，成为国际间农业品种资源交流的重要考量因素[1]。目前，国际上普遍采用简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR）标记和单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）标记作为鉴定品种实质派生现象的主要标记，但SSR标记存在着标记数量有限、对变异反应敏感等问题，同时SNP标记存在着检测成本高的问题。

2019 年4 月底至5 月初，美国百事公司起诉4家印度小农场主侵权使用百事公司的马铃薯品种，要求各农场主支付侵权罚金[2,3]，给了国人一个很重要的提醒。中国马铃薯产品生产中是否也存在此类马铃薯品种侵权或者实质派生现象？如何快速准确鉴定马铃薯实质派生品种？

通过调研发现，通过群体遗传等位基因分子系统进化的方法可以比较个体间两个基因组序列的相似性，这一方法已在相关研究中得到证实，并形成了计算进化距离方法、核酸序列相似度和距离法、特征分值（Identity score，IS）计算办法等[4-8]，这些都可用于作物品种间的相似度和实质派生现象检测[6-10]。本研究将利用基因组测序手段，将结合特征分值及马铃薯系统进化树枝长两种分析方法，探索马铃薯实质性派生品种鉴定的方法。

1 材料与方法

1.1 DNA提取和文库构建、测序和质控

本研究使用的样品由国家马铃薯工程技术研究中心及内蒙古自治区农牧业科学院马铃薯研究中心提供（表1）。马铃薯薯块常温催芽，芽长5 cm左右时，取适量马铃薯块茎芽头组织，用酚氯仿异戊醇抽提法提取DNA。使用NanoDrop 2000 微量分光光度计检测DNA纯度，以满足建库测序要求。

分别构建350 bp、2 K、5 K 文库，进行Illumina PE150 测序、基因组简单组装及变异检测。将1.5 μg 的DNA 用Covaris 破碎机随机打断成长度为350 bp 的片段， 采用TruSeq Library Construction Kit 建库，DNA 片段经末端修复、加ployA 尾、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成文库制备，文库制备后使用Illumina HiSeq 进行PE150 测序。检测合格的DNA 样品通过Covaris 超声波破碎仪随机打断成片段，经末端修复、加ployA、加罗氏环化接头、环化、二次打断、末端修复、加ployA、加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个大片段文库（2 K、5 K、10 K）制备，构建的文库通过Illumina Hiseq PE150测序，得基因组原始数据。数据通过Cutadpat和Trimmimatic软件进行质控，获得高质量Clean data。

1.2 变异检测

用BWA 软件将Clean data 比对到参考基因组上，进行变异检测；再通过Samtools、Picard 软件转换格式，最后使用GATK 的HaplotypeCaller 模块进行变异检测，获得单核苷酸多态性（SNP）变异位点。

1.3 进化树的构建

利用邻接法（Neighbor-joining methods）进行系统进化树的构建。两个体i 和j 之间的p-距离通过如下公式计算[9]：

表1 供试马铃薯样品基本情况Table 1 Basic information of potato samples

式中，L 为高质量SNPs 区域长度，在位置1的等位基因为A/C，那么个体i 和j 之间的d 有下列4种情形：

1.4 特性分值（IS）分析

特性分值（IS），是一种计算不同样品之间序列一致性程度的分析方法，可用于辅助佐证群体结构分析结果。根据群体基因型文件进行打分，将基因型文件转化成由0、0.5 和1 三种遗传距离参数值组成的Dsi 矩阵（纯合且与参考基因组相同者Dsi 为0，纯合且不同于参考基因组的Dsi 为1，杂合的Dsi 均为0.5），然后沿染色体按照每个窗口20 Kb 来 计算 每 个窗 口的IS 值[7-11]。IS 值越 大说 明两个个体间差异越小。

为了保证研究材料的IS 比较的合理性，选择马铃薯二倍体基因组作为统一的参考基因组，比较的每个材料的SNP 位点相对于参考基因组都是一样的。

式中，Si 是在位点i 与参考基因组相似的位点数，n 是20 Kb 的窗口中的SNP 总数，n'是在20 Kb的窗口中缺失的位点数。

2 结果与分析

2.1 马铃薯系统进化树分析

用邻接法构建25 个品种系统进化树，可以反映出品种间的亲缘关系（图1）。以‘Favorita’、‘夏坡蒂’和‘希森9 号’为代表的3 个马铃薯品种展现了其亲缘关系较近的聚类群。

其中，‘YM8’和‘YM13’均为‘夏坡蒂’品种，但来源于不同地区，‘YM8’来自国家马铃薯工程技术研究中心，‘YM13’来自内蒙古自治区农牧业科学院，两者位于同一个聚类中。这说明：第一，进化树枝长可以作为判定亲缘关系的依据；第二，同一品种不同地区的马铃薯由于自然生长环境不同，会导致在个体之中出现不同的自然变异，表现出SNP不完全一致的现象。

‘YM4’和‘YM5’两个样品为同一遗传背景起源的姊妹系，但在进化树中被归为不同的聚类。说明，马铃薯品种是杂合体，且同一个遗传背景，因配子的不同组合，可带来较大的遗传结构组成差异。

‘YM9’（希森3 号），‘YM23’（荷兰15 号）和‘YM10’（荷兰薯费乌瑞它）这3 个品种被聚在一起，而且枝长很短。其实，这刚好反映了这3 个品种的费乌瑞它家族成员的遗传背景（表1），而且无论是‘希森3号’还是‘荷兰15号’都与‘费乌瑞它’具有实质类似的特点。联想到‘费乌瑞它’基本不具备晚疫病抗性和‘希森3 号’是华南和西南地区近年来丰产性很好的稻后冬闲田种植马铃薯的主栽品种，这自然也在提醒冬马铃薯种植者要重视他们种植的马铃薯的晚疫病防控问题。

为验证极短枝长是否可判断超近亲缘关系，从25 个品种中选取14 个品种，选择3 个不同来源的马铃薯新品种‘合作88’作为内控，再选取2 个外型接近的马铃薯品种‘黑金刚’和‘华颂66’，共计20 个马铃薯品种样品作为研究系统进化分析的邻接树构建材料。

由图2 可见，3 个不同来源的内控马铃薯品种‘合作88’被聚在非常近的聚类中，其枝长分别为0.063 0、0.062 3、0.061 2。与此同时，‘YM10’和‘YM23’分别为‘荷兰薯费乌瑞它’和‘荷兰15号’，亲缘关系来自荷兰的品种‘Favorita’，因引种到不同地区，被赋予不同的中文名字（表1），但通过聚类验证，被聚在相同的聚类群中，其枝长较短为0.057 8 和0.057 7。由此可以表明，进化树的枝长可以作为判断马铃薯品种的亲缘关系。对此，‘HJG’（黑金刚）与‘HS66’（华颂66）2 个外型接近的马铃薯品种在同一聚类群中，其枝长分别为0.057 2 和0.057 4，表现为同一品种，应该是互为实质派生品种。

2.2 马铃薯特征分值（IS）分析和分型结果

表2 为20 个马铃薯验证品种的IS 结果，由此可知，3 个不同来源的内控马铃薯品种‘合作88’都有较高的IS 值，分别是0.921 5，0.925 7，0.924 6；同一荷兰‘Favorita’品种的‘YM10’和‘YM23’，其IS 值达到0.928 0，高于‘合作88’所代表的阈值0.925 7。与此同时，‘HJG’与‘HS66’两个外型接近的马铃薯品种间IS 值最高，为0.929 6。此结果也支持‘HJG’与‘HS66’是互为派生品种的判断。

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3 讨 论

马铃薯品种属于营养繁殖的植株块茎材料，在选育过程中存在姊妹系的现象（表1）。这是因为马铃薯亲本选育时对不同相似度缺乏足够的研究，不同于国际顶级育种公司在玉米育种中事先制定标准，严格控制育种亲本时的相似度和姊妹系的出现。与此同时，本研究发现，马铃薯品种间确实存在实质等同现象。育种家往往根据亲本之间有一定差异的原则来进行亲本选择，而派生品种越来越多，马铃薯会失去较大的遗传多样性，很难培育出突破性品种，育种难有提高，长此以往将对国家粮食安全构成严重威胁[10-12]。因此，及时制止这一现象，对保护马铃薯核心种质资源，改良马铃薯品种，提高产量，保护育种者权益，提高育种者投入和研发的动力至关重要。

目前，马铃薯品种间相似度判断仍主要依赖于SSR 标记，但这种方法存在明显弊端[13]，仅能捕捉不及三分之一的差异，受基因组中转座子因子的影响也可能出现假阳性结果，不能真实反映基因组之间的关系。随着高通量测序技术的运用，通过SNP 变异位点的检测，对基因数据进行分析，能对基因组相似度进行定量分析[14,15]。

本研究中，内控的马铃薯品种‘合作88’的三个不同来源的样品通过系统进化分析，枝长极短；通过特征分值（IS）分析，具有较高IS 值，被聚在非常近的聚类中。‘YM10’和‘YM23’为同一品种生长不同环境下，通过系统进化与IS 分析同样发现其枝长极短，IS 值较高。这说明了进化树的枝长与IS 分析，可以作为判断来源不同的马铃薯薯块样品是否来自同一品种，或者是否实质派生品种的依据。‘黑金刚’和‘华颂66’两者之间的枝长比‘合作88’三个不同种植地点所取样品间的枝长要小，特征分值达到了0.929 6，高于同一品种不同来源薯块间的特征分值结果，可以确定是一对实质派生品种的候选者。但是具体用什么特征分值的标准作为检测实质派生品种的阈值，请管理部门主持制定标准的讨论，并且尽快提出检测实质派生的基于特征分值或者基于系统进化分析的建议标准，以解决马铃薯生产中存在的实质派生问题和品种同质化过于严重的问题。

另外，从以上结果也可以得出，即便是同一个品种，在不同种植条件和种植代数下，会存在和积累不同的自然突变，因此，马铃薯品种的同一个品种不同薯块的基因组不会是完全一致的。

综上所述，系统进化树的枝长与特征分值可以作为一个快速判断品种是否存在实质派生现象的依据。建议对所有参加马铃薯品种审定的品种，在进行DUS 测试的同时进行实质派生品种鉴定，并保存DNA样本。