罗梅 阴伟晓 罗朝喜

摘要 由于杀菌剂的长期大量使用，植物病原菌对杀菌剂抗性问题日趋突出，严重影响病害防治的效果。褐腐病是一种在全世界范围内广泛发生和流行的重要果树病害。本文以桃褐腐病菌Monilinia fructicola为例，基于已知的多菌灵抗性机理，即靶标β微管蛋白基因TUB2的点突变E198A，建立了一种桃褐腐病菌对多菌灵抗性的等位基因专化性PCR检测技术。结果表明，碱基错配、内参引物、退火温度、dNTPs、Taq DNA聚合酶、专化性引物浓度及配比等因素均对检测效率有影响。经过对以上因素的优化，并对优化后的检测技术进行专化性及灵敏度评价，证实该检测技术能特异性地鉴别桃褐腐病菌M.fructicola对多菌灵抗性基因型E198A，且检测灵敏度可达到4.342 pg/μL病菌DNA，有望在实践中推广使用。

关键词 桃褐腐病菌; AS-PCR; 抗药性; 多菌灵

中图分类号： S 436.621.13

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019503

Abstract With the increasing use of fungicides， the fungicide resistance has become a serious problem that affects the effect of fungicides in practice. Brown rot caused by the ascomycete fungus Monilinia fructicola is an important fruit disease that occurs and spreads worldwide. In this study， based on the known resistance mechanism to carbendazim， i.e.， the point mutation E198A of the target β-tubulin gene （TUB2）， an allele-specific PCR （AS-PCR） was developed to detect the carbendazim resistance in M.fructicola. The results showed that the detection efficiency was influenced by mismatch of nucleotides， internal reference gene primer， annealing temperature， dNTPs， Taq DNA polymerase， specific primer concentration and ratio etc. After these factors were optimized， the specificity and sensitivity of the developed AS-PCR were evaluated. The results showed that the AS-PCR could specifically identify the carbendazim-resistant genotype E198A at a sensitivity of 4.342 pg/μL of M.fructicola genomic DNA， which may be widely used in practice.

Key words Monilinia fructicola; allele-specific PCR; fungicide resistance; carbendazim

由褐腐病菌Monilinia spp.引起的桃褐腐病在全世界范圍内广泛发生，常对桃产量及品质造成重大影响，严重时造成毁灭性损失。在我国引起褐腐病的病原菌主要有3个种，分别为美澳型核果链核盘菌Monilinia fructicola、云南丛梗孢Monilia yunnanensis和梅生丛梗孢Monilia mumecola。2005年，M.fructicola第一次在我国报道[1]，之后在北京、浙江、福建、陕西、云南等省市相继报道，是引起我国桃褐腐病的优势种[2-3]。目前化学防治仍然是防控该病害的主要手段。

苯并咪唑类杀菌剂（MBC类）是20世纪60-70年代开发出来的一类以苯并咪唑环为母体的高效广谱内吸性杀菌剂，在褐腐病的防治中被广泛使用[4]。其作用机理是与微管蛋白的β亚基结合，干扰微管的组装，从而破坏纺锤体的形成，影响有丝分裂的进行，导致细胞畸形死亡[5]。但由于其作用位点专一，活性较高，极易产生抗性。目前已发现β-微管蛋白多个氨基酸突变，如第6位（H6Y）和第198位（E198A）突变分别导致了M.fructicola对MBCs的低抗性（苯菌灵）和高抗性（甲基硫菌灵）[6];E198K[7]，E198Q和F200Y[8]等点突变也能引起M.fructicola对MBCs的高抗性（甲基硫菌灵）[9];第240位突变（L240F）则导致了核果链核盘菌Monilinia laxa对MBCs的低抗性（多菌灵）[6]。多菌灵抗性菌株的产生主要是由于靶标β微管蛋白基因TUB2上E198A的点突变所导致，主要表现为第931位核苷酸A突变为C[10]。我国关于褐腐病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗性的研究不多，目前仅在北京、山东、云南等省市发现M.fructicola对甲基硫菌灵和多菌灵产生了抗性（E198A）[10-12]。

单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphisms，SNP）主要是指由于单个核苷酸变异引起基因组水平上的DNA序列多态性。等位基因专化性PCR（allele-specific PCR，AS-PCR）是一种简单、高效的检测SNP的高通量检测技术[13]。它主要根据SNP位点设计特异性引物，其中一条链（特异链）的3′末端与SNP位点的碱基互补（或相同），另一条链（普通链）按一般的方法进行设计。特异性引物在一种基因型中有扩增产物，在另一种基因型中没有扩增产物，从而确定基因型的SNP[14]。AS-PCR操作简单，成本低，只需要一台PCR仪和1%琼脂糖凝胶电泳即可实现检测目的。经过不断地改进与完善， 基于SNP的等位基因专化性PCR已逐渐成为一种快速、简便、低成本、可靠、高通量的检测基因型SNP的方法，被广泛使用。

目前已有M.fructicola對MBCs类杀菌剂苯菌灵和甲基硫菌灵的低抗性（H6Y）和高抗性（E198A）的PCR检测报道[6]。2013年，玉蜀黍赤霉Gibberella zeae对MBCs的抗性也是通过设计特异性AS-PCR引物得到了诊断[15]。尚未有M.fructicola对多菌灵抗性（E198A）的分子检测报道。本文以桃褐腐病菌M.fructicola对多菌灵的E198A抗性菌株为研究材料，开发出一项能快速检测桃褐腐病菌对多菌灵抗性的等位基因专化性PCR技术，以期在实践中对抗性群体进行检测，监测抗性发生动态，及时指导病害的防治。

1 材料与方法

1.1 材料

对多菌灵产生抗性（E198A）的桃褐腐病原菌M.fructicola菌株（3株）：YHC11-8c、YHC11-15c、YHC11-17c，均来自中国云南省红河哈尼族彝族自治州。对多菌灵敏感的M.fructicola菌株（12株）：ZM09-1a、BM09-4a、HG12-4b、FJC10-7a、HG12-9a、HG12-14b、HG12-20a、HG12-10b、HN13-1a、Bmpc7、MD1-7、MD1-5。其中Bmpc7、MD1-7、MD1-5来自美国南卡罗莱纳州，其他菌株来自中国浙江杭州、福建莆田、湖北武汉、北京平谷、云南红河等不同桃产区。菌株在PDA培养基上于22℃培养。

DNA聚合酶（Easy Taq DNA polymerase），高纯度dNTPs（2.5 mmol/L High Pure dNTPs），10×Easy Taq Buffer，DNA Marker（Trans 2K， Trans 2K Plus）均购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 基因组DNA提取

采用快速提取的方法。取1.5 mL EP管加0.5 mL DNA提取液（1 mol/L KCl，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA）。挑20～40 mm2菌丝块于DNA提取液中，用细胞破碎仪破碎4 min。具体可根据菌丝生长程度延长破碎时间。12 000 r/min离心10 min，吸上清加入0.3 mL异丙醇。轻轻摇晃混匀几次，出现絮状沉淀，12 000 r/min离心10 min。去上清，用0.8 mL 70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min离心10 min，去上清。37℃开口放15 min，使乙醇挥发。最后加50 μL ddH2O或1×TE溶解DNA。

1.3 引物设计

根据野生型及抗性突变型菌株的β-微管蛋白基因DNA序列差异，第931位核苷酸碱基的不同（抗性菌株为C，敏感菌株为A），通过Oligo7引物设计软件设计特异性引物（specific primers，以下简称SP）进行抗性区分（表1）。选用M.fructicola一个非靶标基因MfCCG8设计内参引物（internal reference primers，以下简称IP），作为PCR扩增阳性对照。引物由武汉天一辉远生物公司合成，浓度为10 μmol/L。

1.4 AS-PCR反应程序

以敏感菌株和抗性菌株的基因组DNA为模板，ddH2O为空白对照配制25 μL的PCR反应体系。10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Primer F/R（SPs）各1 μL，Primer F/R（IPs）各1 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，基因组DNA 1 μL （434.2 ng），ddH2O 15.25 μL。反应条件：94℃预变性3 min;94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃延伸10 min，16℃ 1 min。结束后，PCR产物立即用1%的琼脂糖凝胶检测。

1.5 反应条件及反应体系的优化

为了充分提高检测的特异性及灵敏度，对反应条件及体系充分优化。退火温度：52、54、56、58、60、62℃;dNTPs：0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L;Taq DNA聚合酶（5 U/μL）：0.5、0.75、1、1.25、15、1.75 U（25 μL体系）。反应体系中各个因素每次只优化一个因素，依次进行。优化某一因素时，已优化参数参照优化后最佳用量，其他参数设置同1.4。

引物之间会存在模板竞争、试剂竞争，导致扩增效率不一致。通过正交试验法评价内参引物和特异引物不同浓度梯度以及不同配比对PCR反应扩增效率的影响。引物浓度梯度：0.8、1.6、2.4、3.2 μmol/L;引物配比（IP∶SP）：分别为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8。

1.6 AS-PCR的灵敏度及专化性检测

通过Nanodrop 2000测定抗性菌株（YHC11-8c）的DNA浓度，然后将DNA分别稀释为原浓度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，得到10个DNA浓度梯度进行AS-PCR反应的灵敏度评价。另外选取不同来源的桃褐腐病抗性及敏感菌株，以其基因组DNA用于AS-PCR的专化性检测。

1.7 AS-PCR的实用性检验

2×Taq PCR Mix是目前流行的PCR扩增预混液，是将除了模板、引物以外的其他组分按照最佳配比混合在一起的混合液，使用时直接加入模板和引物即可，操作简单，节省时间。本文以2×HieffTM PCR Master Mix（YEASEN）替代Taq DNA聚合酶和dNTPs，以优化的退火温度，最佳引物浓度及比例进行PCR反应，与本文建立的检测体系作比较。

2 结果与分析

2.1 不同引物對AS-PCR结果的影响

本试验设计出的针对SNP位点的特异性引物为8CF911和8CR1394。同时为了增强引物的特异性，在特异性引物3′端倒数第二位/第三位引入不同的错配碱基，以避免非特异性延伸（表1）。

不同的错配类型对PCR反应的结果有影响，说明错配碱基的引入有利于提高引物特异性。引入G-A错配和G-T错配的引物无法实现抗/感菌株的区分且在反复验证的过程中不稳定。引入G-C错配的引物能够很好地扩增出抗性菌株基因型，而无法扩增出敏感菌株基因型，条带亮，结果稳定。引入TG-CA错配的引物组同样能实现抗性菌株与敏感菌株的区分，但条带亮度较弱，扩增效率不高。经比较，选取引入G-C错配的引物组作为特异性引物（图1）。

2.2 内参引物对AS-PCR的影响

为指示PCR反应成功与否，特引入了内参PCR引物，扩增片段大小为1 020 bp。测试的两组内参引物都能较好地扩增出抗性菌株和敏感菌株的DNA，但5-For-MfCCG8/5-Rev-MfCCG8引物组，空白对照和敏感菌株均出现了微弱的假阳性非特异性条带，重复试验结果相同。故选择结果稳定、条带清晰，在阴性对照中不产生非特异性扩增的引物组3-For-MfCCG8/3-Nest-MfCCG8作为内参引物（图2）。

2.3 AS-PCR反应条件的优化结果

退火温度是影响PCR特异性的重要因素。理想状态下，退火温度要足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合，因此需确定最佳的退火温度。结果显示，不同温度梯度下，52～58℃均能实现抗性区分，60～62℃因为温度过高，模板与引物无法有效退火而无法实现抗性区分。56℃和58℃条带亮度很暗，扩增效率较低。52℃和54℃条带很亮，54℃更接近于两对引物的Tm值。为保持一致性，保证引物与模板很好地结合以及提高扩增效率，选择54℃作为最适的退火温度（图3）。

2.4 AS-PCR反应体系的优化结果

反应体系中包含dNTPs、Taq DNA聚合酶等试剂，其质量及浓度是影响PCR反应的扩增效率以及避免产生非特异性扩增的重要因素。dNTPs的优化结果表明在设置的各个浓度梯度下反应均能发生，但特异性引物扩增的效率略有不同。0.2～0.3 mmol/L浓度扩增效率相对较高（图4a）。依据标准的PCR反应体系中推荐的dNTPs浓度为0.2 mmol/L，本着效率优先，节约为辅的原则，确定dNTPs的最佳浓度为0.2 mmol/L。Taq DNA聚合酶的优化，在不同的Taq DNA聚合酶浓度下反应均能发生，但特异性引物扩增的条带亮度随浓度增加大致呈依次递增的关系（图4b）。结果显示在Taq DNA聚合酶浓度为1.25 U下扩增的效率已较高，且接近推荐的浓度，故确定Taq DNA聚合酶的用量为1.25 U（25 μL体系）。

2.5 AS-PCR引物比例及引物浓度的优化

不同引物的浓度及配比影响PCR反应的扩增效率，不同引物对反应条件以及反应体系存在不同程度的相互竞争导致扩增效率不一致。以抗性菌株YHC11-8c为例，利用正交试验测试了内参引物和特异引物不同浓度和不同配比下PCR的扩增效率变化。

结果发现，在引物总浓度≥2.4 μmol/L（图5c）时，两种引物对间的相互竞争作用明显减弱，在不同配比浓度下扩增效率达到了一致。同时发现在特异性引物与内参引物的比值为4时，这种竞争作用基本被消除。另外通过观察比较以及计算，发现内参引物的浓度≥0.266 7 μmol/L（图5a 4泳道）时，扩增的效率已较高，趋近饱和。特异性引物的浓度≥0.48 μmol/L（图5c 1泳道）时也能够达到很高的扩增效率，但容易受到引物间相互竞争作用以及总浓度的限制（图5a和图5b）。本着效率优先，节约为辅的原则，确定引物最佳总浓度1.6 μmol/L，IP∶SP的最佳比值为1∶4（25 μL体系）。

2.6 AS-PCR专化性检测

本试验使用3个由β-微管蛋白的E198A突变引起的抗性菌株YHC11-8c、YHC11-15c、YHC11-17c和来自不同地理区域的12个敏感菌株评价建立的AS-PCR检测方法的专化性。由图6可见，该检测技术可以专一性地从不同来源的敏感菌株群体中检测出抗性菌株，证明该检测技术具有较高的特异性，在实践中有很强的实用性。

2.7 AS-PCR灵敏度检验

通过Nanodrop 2000测定抗性菌株YHC11-8c的DNA浓度为434.2 ng/μL，将DNA分别稀释为原浓度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，得到10个DNA浓度梯度，进行3次独立重复试验。结果发现该检测技术的灵敏度很高，最低可从稀释为10-5（4.342 pg/μL）的病原菌DNA中检测出抗性菌株，完全可用于生产实践（图7）。

2.8 AS-PCR的实用性

如图8所示，使用Mix体系扩增的PCR反应能够专一性地扩增抗性菌株基因型，实现抗性区分，但特异性引物扩增效率偏低，目标条带较暗（图8b）。可能由于Mix是一种混合液，无法针对性地对各个成分进行优化。因此，使用Mix的PCR扩增技术虽然简单方便，但存在局限性，在生产实践上不及经过充分优化开发出的抗性检测技术。

3 结论与讨论

本研究成功建立了应用于桃褐腐病菌M.fructicola对多菌灵抗性的等位基因专化性PCR检测技术。研究对反应条件以及反应体系进行优化，充分提高了该检测技术的特异性以及扩增效率。最后对检测方法进行评价，证明其稳定，可靠性强，应用前景广阔。

桃褐腐病菌对MBCs类杀菌剂产生抗性的现象非常普遍[9]。病原菌在自然界中数量庞大，抗药性个体在群体中的比例达到3%时，即可引起抗药性群体流行，导致药剂防治失败。因此开展植物病原菌的抗药性检测，能为植物病害的有效防治和抗药性治理提供实际指导[16]。2013年，Liu等开发出了玉蜀黍赤霉Gibberella zeae对多菌灵的多个抗性点突变的AS-PCR分子检测技术[15]。该技术在生产上抗药性检测中发挥了重要作用。近年来，已在不同植物病原真菌中建立了针对MBCs类杀菌剂抗性的相关分子检测技术[17-18]。同时，也有褐腐病菌M.fructicola对三唑类杀菌剂抗性的分子检测技术报道[19]。然而到目前为止，国内外尚未有桃褐腐病菌对多菌灵抗性的相关分子检测报道。

PCR技术作为一项基本分子生物学技术已被广泛应用到各研究领域中，且随着发展需要衍生出各种各样的PCR方法，如实时荧光定量PCR、限制性片段长度多态性（RFLP）等，大多比较繁琐耗时，且价格昂贵，在生产实践中并不适用[20]。本研究中开发的等位基因专化性PCR方法， 成本低易操作，仅一台PCR仪和一对特异性引物即可实现SNP的检测。与已开发M.fructicola对MBCs类的苯菌灵和甲基硫菌灵的低抗性（H6Y）和高抗性（E198A）的PCR检测技术相比，对反应体系和反应条件进行了充分优化，大大提高了灵敏度（4.342 pg/μL），可以在生产实践中使用。

通常情况下，对许多聚合酶（包括 Taq DNA聚合酶）来说，引物的3′末端必须与模板完全互补才能产生有效的聚合反应。但在某些情况下，即使引物的3′末端碱基与模板不互补，延伸仍然可以进行，只是延伸效率仅有前者的10-6.6～10-3倍[21]。为避免这种非匹配延伸，引起假阳性，需要在突变点前第二或第三位引入错配碱基[12]。一个碱基有三种替换方式，不同的替换对PCR的结果有不同影响。参考Little等[21]引入错配碱基的原则，把碱基之间错配的不稳定性分为4类：T/T、C/T、G/A之间的错配最不稳定，C/C之间错配的不稳定性次之，A/A、G/G 之间错配的不稳定性居中，C/A， G/T 之间的错配不稳定性最弱。引物3′末端碱基的错配如果是强不稳定性，则引入的第二个碱基错配类型应该用弱不稳定性;反之， 则用强不稳定性;引物3′末端的错配如果是中等不稳定性，则引入的错配类型也应用中等不稳定性。本研究中引物3′末端的错配为强错配（A-C），需引入弱的错配（G/A）或者不引入错配。从试验结果来看，引入G-A错配（弱错配）和G-T错配（强错配）的引物均无法实现抗性的区分，敏感菌株和抗性菌株基因型均有条带出现（图1）。前者可能是由于A碱基的引入导致引物间Tm值（520℃）差异较大的缘故，以致出现了非特异性扩增;后者或许是不满足引入错配的原则，强强错配反而不稳定。引入G-C错配的引物能够专一性地扩增出抗性菌株且结果很稳定，G-C错配的引入对Tm值没有影响，GC含量没有变化，推测G-C错配可能是一种中等错配（图1，12泳道）。倒数第三位和第二位分别引入T-C和G-A错配（均为弱错配）的引物能实现抗性菌株与敏感菌株的区分，但条带亮度较弱，扩增效率不高（图1，15泳道），符合Little等提出的引入错配原则。

dNTPs以及Taq DNA聚合酶的各个浓度处理间扩增效率差别并不大，多次重復结果相同（图4）。用Nanodrop 2000对反应后PCR产物的核酸浓度进行检测发现，随dNTPs浓度增加，扩增产物浓度呈线性递增的趋势，说明扩增的效率与dNTPs浓度呈正相关。随Taq DNA聚合酶浓度增加，扩增产物在1.25 U时达到峰值（图4）。优化过程中扩增效率差别不大的原因或许是dNTPs和Taq DNA聚合酶对扩增效率影响较小。

内参引物和特异引物浓度配比及其他因素对检测结果存在影响。复合扩增中存在的模板竞争以及试剂竞争等会导致扩增的不平衡。随着复合扩增位点的增加，引物数量越来越多， 引物间的相互作用也会导致非特异性扩增， 引物间的最佳浓度配比就成为扩增体系的关键因素之一。本实验通过正交试验确定了最佳浓度配比（IP∶SP为1∶4）以及最佳浓度用量（1.6 μmol/L）[13]，且发现引物浓度配比存在某种饱和度，在达到某个值时，将不受竞争作用以及浓度变化的影响，扩增效率达到一致（图5）。

专化性及灵敏度检测表明，该检测技术可以专一性地从不同来源的群体中检测到抗性菌株，且可检测到DNA的最高稀释限度为皮克级别，具有很高的特异性及灵敏度，实际生产中适用性强。与使用Mix混合液的PCR反应比较，本试验建立的高通量AS-PCR检测技术显示出更优越的适用性及特异性（图8）。

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