史庆丰，黄英男，孙 伟，崔扬文，胡必杰,，高晓东

(复旦大学附属中山医院 1. 感染管理科； 2. 感染科，上海 200032)

肺炎克雷伯菌是一种可以导致社区获得性感染和医院感染的常见致病菌，可无症状定植于正常人群呼吸道和肠道，并可广泛分布于水生环境中，尤其以医院重症监护病房(intensive care unit, ICU)分离和报道最为多见[1]。近年来，随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，我国住院患者送检标本中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的分离率呈上升趋势[2]，其感染可造成26%～44%的归因死亡[3]。ICU环境物体表面以及诊疗设备作为医务人员手最频繁接触的地方，也是多重耐药菌最容易定植和传播的关键场所。本次研究对某综合医院多个外科ICU进行环境采样，分析ICU CRKP污染现状并初步探讨其环境流行的特点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 mSuper CARBA显色培养基(江苏科马嘉微生物技术有限公司)，灭菌棉签，无菌PBS缓冲液，MALDI-TOF质谱仪，PCR Master Mix试剂盒(美国Thermo公司)，D2000 DNA marker(北京天根生化科技有限公司)，PCR仪(美国Bio-rad公司)，电泳仪(美国Bio-rad公司)。

1.2 采样地点 选取某三级综合医院5个外科ICU(急诊ICU、心外ICU、肝外ICU、大外科ICU、外科ICU A)进行环境采样，所有ICU采样点均在近期检出过CRKP患者的病床周围。采样前未通知相关科室，采样时间为工作日10:00左右，所采病区均已完成当日常规环境清洁消毒。

1.3 采样方法 使用浸有PBS的无菌棉签，对以下地点进行采样：①选取床栏、呼吸机面板、听诊器、枕头等医务人员床旁高频接触的物体表面；②治疗桌表面、手持机表面，病房公用电脑键盘、药品存储柜的把手、治疗车把手；③选取洗手池壁、排水孔，治疗室洗手池壁、排水孔，污物间拖把清洗池壁、排水孔，污物排放池壁、排水孔；④护理CRKP定植/感染患者的护工工作服领口、袖口、口袋口等。按照《医院消毒卫生标准》[4]要求进行采样：规则或平整表面使用棉签采集面积5 cm×5 cm的区域，不规则或不平整的物体表面使用无菌棉签直接涂抹采样。将采样好的棉拭子放置于含有中和剂的试管中保存并转移。将已采样的棉拭子在mSuper CARBA显色培养基平血上反复均匀涂抹5次将平血置37℃恒温箱培养48 h。

1.4 碳青霉烯酶鉴定 根据显色培养基说明书，挑取金属蓝色、深蓝色的细菌菌落使用MALDI-TOF质谱仪进行菌种鉴定。使用双纸片协同法联合EDTA-Na2对过夜培养的细菌进行碳青霉烯酶表型鉴定。

1.5 DNA提取 使用接种环挑取碳青霉烯酶表型阳性的4～5个纯菌落转至1.5 mL EP管中，加入1 mL无菌双蒸水，震荡混匀后悬于100℃加热仪中裂解30 min。取出离心管，13 000 r/min离心10 min，取上清液分装于新EP管中，作为PCR试验细菌DNA模板。

1.6 产碳青霉烯酶基因的检测 KPC和NDM引物序列见表1[5]，由上海生工生物技术公司合成。选用含KPC耐药基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1705作为KPC阳性对照，不含KPC耐药基因的肺炎克雷伯菌ATCC 1706作为阴性对照。临床分离且NDM耐药基因阳性的肺炎克雷伯菌株作为NDM阳性对照，临床分离且NDM鉴定阴性的肺炎克雷伯菌株作为阴性对照。PCR反应体系上下游引物各1 μL，DNA模版2 μL，双蒸水21 μL。扩增条件均为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共计35个循环，最后72℃循环10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电压为100 V，电泳30 min后在凝胶成像系统上阅读结果。

表1 碳青霉烯酶耐药基因引物序列和产物大小

2 结果

2.1 采样结果

2.1.1 床旁高频接触物表采样结果 床旁共计采样73份，其中床栏27份，听诊器9份，呼吸机面板28份，枕头9份。心外ICU床栏处分离1株CRKP，其余采样点均未分离到CRKP菌株。见表2。

表2 床旁高频接触物体表面CRKP检出情况(阳性标本数/采样标本数)

2.1.2 公共区域采样结果 公共区域共计采样89份，其中治疗桌33份，手持机29份，电脑键盘11份，储物柜把手9份，治疗车把手7分。外科ICU A某床手持机分离到1株CRKP，其余采样点未分离到CRKP。见表3。

表3 公共区域环境CRKP检出情况(阳性标本数/采样标本数)

2.1.3 水池采样结果 ICU水池共计采样59份，其中30份分离出CRKP。主要分离于洗手池孔、治疗室水池孔、污物倾倒池壁和池孔。见表4。

表4 ICU水池CRKP检出情况(阳性标本数/采样标本数)

2.1.4 护工衣物采样结果 对CRKP定植/感染患者护理的8名护工进行采样，1名肝外ICU护工袖口处分离到CRKP，其余采样点未分离到CRKP。见表5。

表5 护工衣物CRKP检出情况(阳性标本数/采样标本数)

2.2 碳青霉烯酶表型鉴定结果 碳青霉烯酶表型鉴定结果显示，28株CRKP中5株产A类酶，11株产B类金属酶。见表6。其中心外ICU床栏分离的1株CRKP以及水池孔分离的2株CRKP同时产A类酶和B类酶。

表6 28株CRKP碳青霉烯酶表型鉴定结果

2.3 碳青霉烯酶耐药基因鉴定结果 PCR检测结果显示，2株CRKP携带KPC型耐药基因，3株CRKP携带NDM型耐药基因。其中心外ICU床栏分离的CRKP同时携带KPC和NDM耐药基因。见图1。

注：M为DL 2000 DNA Marker; Marker左侧为KPC耐药基因PCR结果，其中1泳道标本来自心外ICU床栏分离标本，2泳道标本来自肝外ICU护工袖口，3～5号来自水池孔标本，6号为KPC阴性对照(肺炎克雷伯菌ATCC 1706)，7号为KPC阳性对照(肺炎克雷伯菌ATCC 1705)。Marker右侧号为NDM耐药基因PCR结果，其中1号泳道标本来自心外ICU床栏分离标本，5号标本分离自外科ICU A手持机，12号为NDM阴性对照，13号为NDM阳性对照标本，剩余样本分离自ICU洗手池。

3 讨论

近年来，CRKP呈现全球广泛流行的趋势，正常人可通过食物摄取使其在胃肠道无症状定植[6-8]。国外研究已证实，50%耐碳青霉烯类肠杆菌(carbapenem-resistant Enterobacteria，CRE)定植患者可在住院30 d内发展为CRE感染，其感染风险是非定植患者的10.8倍。然而同源分析显示，其中仅1例患者的肠道定植菌与感染菌同种同源，提示医务人员和ICU周边环境在CRE传播中起到关键作用[9]。国内外多项研究指出，CRKP在ICU暴发或流行期间，加强医务人员手卫生、环境清洁和消毒以及进行隔离可有效降低相关感染的发生[10-11]，但研究多聚焦于医院感染预防措施和临床结局，对相关环境污染的调查较为少见。尽管国内相关规范和医院标准操作流程已对环境清洁和消毒的频次、消毒剂的浓度以及擦拭顺序进行了详尽的指导，但仍无法杜绝CRKP在ICU的流行，提示日常环境清洁和消毒可能存在盲点。

本研究使用mSuper CARBA显色培养基进行环境CRKP筛查，该培养基含有碳青霉烯类抗生素，可有效抑制对β-内酰胺酶敏感，产ESBLs、Ampc酶细菌的生长，CRKP菌株在接种24 h后会显示金属蓝色或深蓝色。经MALDI-TOF质谱仪进行菌种鉴定后，可较为准确识别环境中的CRKP。本次采样未能在CRKP患者床单元的高频接触物体表面，如床栏、呼吸机面板、听诊器、患者使用的枕头分离到CRKP，同时公共区域内的高频接触物体表面，如治疗桌面、手持机、电脑键盘、存储柜把手以及治疗车把手上也未能分离到CRKP，与廖睿纯等[12]的研究结论类似，可能与本次采样前各ICU病区已完成常规环境清洁和消毒，且工勤人员执行情况较好有关。

研究证实水龙头可被大量奥斯陆莫拉菌污染，并伴随喷溅的水污染周围直径约70 cm的区域[13]。水龙头水直接流向水槽排水管或水槽内表面的冲击力会导致细菌扩散，对水龙头上方10 cm处的空气采样发现铜绿假单胞菌，达439 CFU/m3，或成为ICU潜在致病源[14]。水槽的深度可能是细菌传播的关键因素，水槽深度>19 cm时细菌喷溅污染概率将大大增高[15]。本次采样的5个洗手池与患者病床存在2～5 m的物理间距，但CRKP仍在洗手池孔、治疗室水池孔、污物倾倒池壁和池孔大量定植。ICU洗手池除进行手卫生外，偶尔还存在倾倒患者体液，冲洗患者使用过的仪器或器具等不当行为，可能是多重耐药菌在水槽中广泛定植的主要原因。尽管近5年的医院监测结果显示，5个外科ICU未曾发生CRKP感染暴发事件，但有文献报道显示，由水槽所引起的CRE感染暴发平均持续时间为37个月，病例之间平均间隔可长达10.2个月，引起暴发的水槽存在清洁和消毒困难等问题[16]，更换水槽或管道后暴发终止[17-19]，给医院感染的识别带来巨大的挑战。

产KPC酶和/或产NDM酶是我国25省市CRKP临床分离株的主要耐药机制，且2个耐药基因携带率分别高达74%和17%，部分菌株同时携带有2种耐药基因[20]。本研究结果显示，水池分离的CRKP和高频接触的环境表面分离的CRKP菌株特征差异较大。研究[21]显示，ICU管道污水和外部检修孔采集的所有标本均含有产碳青霉烯酶的微生物，虽然环境中采集到的CRE与患者标本中采集的CRE在细菌种属类别和药物敏感性上均存在差异，但两者存在密切的质粒交换，考虑可能CRE主要在排水管中发生接合和重组，继而通过环境清洁和医务人员手卫生等行为导致住院患者发生感染，所以仍值得警惕和进一步研究。

本研究存在以下的局限：①未能对ICU所有可能污染的区域进行长期的、系统的采样，对了解CRKP环境动态分布和传播存在一定盲点；②仅重点关注CRKP的环境污染现状，对医务人员的手、衣物以及个人用品未进行采样分析，对医务人员在CRKP传播中的媒介作用未能很好的分析；③受限于研究经费和时间的影响，本研究尚未完成环境与临床分离CRKP的同源性鉴定，因而未能明确护工袖口处分离的CRKP是否来源于所护理的患者，无法推测CRKP感染路径。