谷思宇 杨晓梅 贺俊崎

(首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学学系，北京 100069)

1 获奖者简介

1.1 埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)

Emmanuelle Charpentier (图1)，1968年12月11日出生于法国奥尔日河畔瑞维西。本科就读于巴黎第六大学(UPMC)，后进入巴斯德研究所攻读博士学位(1986-1995)。1996-1997年，分别于巴黎巴斯德研究所和纽约洛克菲勒大学进行博士后研究。2002年，在维也纳建立自己的实验室。2009年6月赴瑞典于默奥微生物研究中心继续研究，8月她的小组通过实验探明了CRISPR系统的机制。2011年之后与杜德纳合作发展CRISPR技术。现就职于德国柏林马克斯·普朗克病原学研究室。

1.2 詹妮弗·杜德纳(Jennifer A.Doudna)

Jennifer A.Doudna(图2)，1964年出生于美国华盛顿特区。1895年,Doudna获得波莫纳学院学士学位，1989年，获得哈佛大学博士学位，毕业后于麻省总医院和哈佛医学院进行分子生物学博士后研究。现为美国加州大学伯克利分校教授，霍华德·休斯医学研究所研究员。

图2 Jennifer A.Doudna

2 主要科学贡献：建立CRISPR/Cas9系统

自DNA双螺旋结构发现以来，用于制造和操纵DNA的技术已在生物学上取得了进步。1972年，P.Berg构建了第一个DNA重组分子，标志着生物基因工程的核心的开始。但在细胞和生物体的基因组中引入位点特异性修饰仍然难以实现。在CRISPR/Cas9技术用于基因组编辑之前，科学家们开发了使用DNA-蛋白质识别原理的锌指核酸酶(ZFNs)和TAL效应因子核酸酶(TALENs)进行基因编辑。然而ZFN基因编辑有很强的局限性，不能识别任意目标基因序列，并且识别序列经常受上下游序列影响。TALEN 技术利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，克服了ZFN方法的不足，但在构建过程中，TALE 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作。对于普通实验室的可操作性较低。因此，迫切需要一种高效、易操作的基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统应运而生。

1987年，Nakata博士领导的课题组在K12大肠杆菌中研究其目的基因iap时偶然间发现了一段串联间隔重复序列，且这些重复序列被含32个碱基的序列间隔开，而当时并不清楚这种序列的生物学意义[1]。2002年，Jansen博士领导的实验室通过生物信息学分析，发现了一种新型的重复DNA序列家族，且该家族只存在于原核生物中，在真核生物及病毒中却不存在，这种序列被称为规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)，并在含CRISPR的原核生物中发现了4个与CRISPR相关的(cas)基因(cas1,cas2,cas3,cas4)，且cas基因始终位于CRISPR基因座附近[2]。2005年，Mojica博士等多位科学家发现CRISPR中的间隔序列来自于外来噬菌体或质粒，病毒无法感染携带有与病毒同源间隔序列的细胞，而易侵入那些没有间隔序列的细胞，由此他们提出CRISPR可能参与细菌的免疫功能的假说。2007年，这一假说被Danisco 公司的两位科学家——Rodolphe Barrango和Philippe Horvath所证实。他们发现嗜热链球菌中存在 CRISPR 序列，能够帮助细菌识别、抵抗噬菌体DNA的侵入[3]。

2011年，本次诺奖得主之一 的Emmanuelle Charpentier博士发现了CRISPR基因编辑系统的最后一块拼图-tracrRNA，由此CRISPR系统最终可以实现定向剪切目标基因[4]。随后Emmanuelle Charpentier博士与另一位诺奖得主Jennifer A.Doudna博士合作研究CRISPR基因编辑系统在试管中精确切割DNA，2012年，两人将CRISPR-Cas9的研究成果公之于众。同时，这两位科学家所带领的研究团队纯化出了Cas9蛋白，发现了Cas9 的切割作用和crRNA 的定位作用，并首次利用这个系统对特定DNA分子在体外进行靶向切割化学反应，显示出CRISPR在活细胞中修改基因的能力。她们是最早从事把细菌天然免疫系统演变成CRISPR/Cas9基因编辑工具研究的科学家，她们为该技术后续的应用勾勒出基本的框架和路线。

随后，麻省理工学院的华人科学家张锋和来自哈佛大学医学院的George Church改进了技术，成功地将 CRISPR-Cas9系统运用到真核生物(哺乳动物)细胞中[5]，使人们开始认识到这一技术的变革性力量，由此极大地推动了CRISPR/Cas9技术在生命科学研究领域内的推广和应用。张锋和他所在的Broad研究所在美国拥有CRISPR/Cas9技术应用于所有真核生物——包括植物、动物和人类的专利，这是CRISPR技术商业化最为核心的专利之一。

麻省理工学院教授Phillip Sharp(1993年诺奖得主)曾表示：Charpentier、Church、Doudna和张锋是建立CRISPR基因编辑技术最重要的贡献者。然而基于诺奖传统最多颁给三人的传统习俗，他们无法共享诺奖。因而他认为一个比较合理的组合是：诺贝尔化学奖颁给Doudna和Charpentier，以彰显她们在CRISPR/Cas9技术建立过程中生物化学方面的研究成就；生理或医学奖颁给Church和张锋，以彰显他们在活体细胞中成功建立了CRISPR/Cas9技术体系，为该技术的医学应用铺平了道路。因此2020年诺贝尔化学奖颁发给Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A.Doudna博士，作为该技术的初创者，她们获奖是实至名归。对于此次错失诺贝尔奖，Church博士坦然接受并认为诺贝尔委员会做出了“一个非常明智的选择”。他认为他们中的任何一个人都不会因为没有获得诺贝尔奖而受到轻视。在他看来Charpentier和Doudna做出了一项重大发现，这是委员会授予她们诺贝尔奖的原因，而他和张锋更像是技术发明家。他甚至还打趣说：“如果有人想获得如何不获得诺贝尔奖的任何技巧，那很容易。” “通过专注于发明，我已经谨慎地避免了所有此类烦恼。” 他还说，张锋仍很年轻，“张锋充满了创意，我毫不怀疑他将来会获得一两个。”

3 CRISPR/Cas9系统原理

CRISPR是细菌中成簇存在的被规律间隔的短回文重复序列，是一种古老的抵御病毒入侵的方式。在噬菌体感染细菌时，噬菌体的一段 DNA序列，会整合入细菌的CRISPR重复序列中，当该噬菌体再次入侵时，那么这个免疫系统会被激活，来干扰噬菌体DNA。CRISPR 序列会转录出一段与先前整合的那段噬菌体DNA序列互补的 RNA，即 CRISPR RNA (crRNA)，然后 crRNA、Cas蛋白核酸酶组成CRISPR/Cas系统，特异性识别并切割噬菌体DNA[6](图3)。

图3 CRISPR干扰的免疫过程[6]

根据参与作用的Cas蛋白基因的序列和结构特点，CRISPR-Cas系统可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三种类型[7]，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系统的标记基因分别为Cas3(属于解旋酶家族成员) 和Cas10(具有和核酸聚合酶以及核酸环化酶同源的结构域)，除此之外还需要多种相关 Cas 蛋白，基因编辑系统较为复杂[8](图4)。而Ⅱ型CRISPR-Cas是三种类型中最简单的系统，仅需要一种Cas9蛋白[9]。

目前使用的CRISPR/Cas9系统中，crRNA和tracrRNA被组合在一起改造成向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)，指导Cas9蛋白定点切割DNA序列。该系统需要在靶标DNA上有一段保守的前间隔区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)作为搜索目标。对于Ⅱ型CRISPR系统一般为5-NGG-3′序列，一旦找到PAM，Cas9就使DNA局部解链，sgRNA与DNA互补，Cas9对靶序列进行定点剪切。

4 CRISPR/Cas9系统应用前景、挑战与争议

4.1 应用前景

在过去的几年内，研究人员已成功地将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用到多种生物中,极大地促进了生物基因组功能的研究。

4.1.1 植物和动物

通过基因编辑技术实现对植物多基因调控性状的改良，如耐寒、抗旱和高产优质新品系的筛选培育。如WRINKLED(WRI)在大豆油脂合成积累中具有关键作用，闫丽[10]利用CRISPR/Cas9技术通过抑制转基因受体植株中内源基因GmWRI11a的表达，创制大豆GmWRI1a基因突变体，发现转基因突变体植株中糖酵解和脂肪合成相关基因的表达量下降，解析了该基因在调控大豆种子油脂合成中的作用。在动物研究方面，CRISPR 基因编辑技术已被成功应用于小鼠、大鼠、斑马鱼、果蝇和猴子等的基因组编辑。

4.1.2 医学

基因编辑技术已经用于药物研发、疾病治疗和异体器官移植等。如四川大学华西医院胸部肿瘤科卢铀教授团队进行了首次CRISPR-Cas9基因编辑的人体临床试验，并于2016年10月进行了首例受试者治疗，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在体外T细胞中编辑PD-1基因，经体外T细胞培养扩增，再输回非小细胞肺癌(NSCLC)受试者，首次证明了该疗法在NSCLC中的安全性和可行性[11]。

4.2 挑战与争议

4.2.1 脱靶效应及伦理问题

2018年11月26日，前南方科技大学副教授贺建奎宣布一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿于11月在中国健康诞生，由于这对双胞胎的一个基因(CCR5)经过修改，她们出生后即能天然抵抗艾滋病病毒(HIV)。这一消息瞬间震动了世界。“基因编辑婴儿”事件之所以引起社会强烈关注，一方面是因为该技术的不确定性，脱靶效应这一有争议的问题一直影响着CRISPR/Cas9系统的应用，会给受试者和婴儿均带来巨大的健康隐患，另一方面则更多的是因为存在伦理问题，这种行为肆意践踏基因编辑技术临床应用的伦理底线，违背有关人类受试者试验研究的基本规范，编辑人类生殖细胞基因可能会带来无法预知的灾难性后果，出于安全风险、社会及医学伦理等方面的考虑，基因编辑技术的应用仍有待严格规范。

4.2.2 专利之争

持续多年的CRISPR专利争夺主要在Broad研究所的张锋团队与加州大学伯克利分校的Doudna团队之间展开。虽然加州大学伯克利分校率先在欧洲专利局提交了关于将CRISPR技术用于cell-free系统中专利的申请，但是张锋和Broad研究所抢先一步在美国获得了真核细胞CRISPR/Cas9基因编辑技术的专利授权，而这正是该技术最有应用前景的领域。加利福尼亚大学一方于2017年4月对这项裁决提起上诉，称他们的原始应用覆盖了所有细胞、植物、动物和人类，而不是只局限于细菌的基因编辑。2018年9月份，美国联邦巡回上诉法院裁定，维持美国专利审判与上诉委员会的判决。张锋和Broad研究所将继续拥有在真核生物中使用CRISPR基因编辑的知识产权。Doudna博士虽然没有赢得真核细胞CRISPR/Cas9基因编辑技术的专利授权，但是此次荣获诺贝尔奖，也是失之东隅,收之桑榆。

5 小结

2012年，Jennifer A.Doudna和Emmanuelle Charpentier两位教授向 《科学》投文“the Cas9 endonuclease can be programmed with guide RNA engineered as a single transcript to cleave any double-stranded DNA sequence”，仅用了20天编辑部就接受了该文。这篇文章标志着对CRISPR/cas9系统的最后技术突破，为CRISPR作为基因编辑工具的应用奠定了坚实的基础。2020年10月7日，仅8年时间，两位教授就摘取了诺贝尔奖桂冠。这主要归功于基因编辑CRISPR-Cas9技术的重要性和影响力。如今，CRISPR/Cas9技术已渗透到生命科学学科的各个领域。也为整个科研界一场深刻的革命奠定了基础。