（广东省汕头市澄海苏北中学 广东汕头 515829）

限制性核酸内切酶是一类在DNA分子特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅助因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ三种类型。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解；Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。由于Ⅱ型限制性内切酶所识别的位置多为短的回文序列（palin⁃drome sequence），所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列，所以是基因工程上实用性较高的限制酶种类，如EcoRⅠ、HindⅢ。

1 区分限制酶、DNA连接酶、DNA酶和DNA聚合酶的方法

限制酶、DNA连接酶、DNA酶和DNA聚合酶是一组易于混淆的概念，原因是它们的作用均与脱氧核苷酸链上的磷酸二酯键有关。限制酶和DNA酶均可剪切磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶均可催化形成磷酸二酯键。限制酶和DNA连接酶用于剪切或连接DNA链（或片段），DNA酶和DNA聚合酶用于剪切或连接游离的脱氧核苷酸分子。在明确了以上联系和区别后，教师可以引导学生构建如图1所示知识模型来帮助理解和掌握。

2 限制酶具有的存在特点和作用特点

限制酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4 000种限制酶。限制酶在细菌细胞中普遍存在，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制酶，多者在一属中就有几十种，例如在嗜血杆菌属中（Haemophilus）现已发现的就有22种。有的菌株含酶量极低，很难分离定性；然而在有的菌株中，限制酶含量极高。如E.coli的pMB4（EcoRⅠ酶）和H.aegyptius（HalⅢ酶）就是高产酶菌株。据报道从10g的H.aegyptius的细胞中，就能分离提纯出可剪切破坏l0 g λ噬菌体DNA的酶量。到目前为止，细菌是限制酶，尤其是特异性非常强的Ⅰ类限制酶的主要来源。

限制酶能特异性识别DNA序列中的回文序列并进行剪切。有些限制酶的切割位点在回文的一侧（如EcoRⅠ、BamHⅠ、Hind等），因而可形成黏性末端。另一些限制酶如AluⅠ、BsuRⅠ、BalⅠ、HalⅢ、HPaⅠ、SmaⅠ等，切割位点在回文序列中间，形成平末端。

3 不同种的限制酶识别的序列？

并非不同种类的限制酶一定识别不同的序列。有很多来源不同的限制酶有相同的碱基识别顺序，这些种类的酶称为异源同功酶。需要注意的是这些酶虽然有相同的识别序列，但它们的切点并不完全一样。例如，XmaⅠ和SmaⅠ都识别六核苷酸CCCGGG，但XmaⅠ的切点在C↓CCGGG，而EmaⅠ的切点则在CCC↓GGG，前者切割DNA分子，形成带有CCGG黏性末端的DNA片段，而后者则会形成平末端。当然，也有识别序列和切点都相同的酶，如HapⅡ、HpaⅡ、MnoⅠ，都能识别序列CCGG且具有相同的切点。

4 宿主细胞的限制酶不会破坏自身DNA分子的原因

限制酶的限制作用实际就是一种通过限制性降解外源DNA来维护宿主遗传稳定的保护机制。限制酶一般不会剪切自身DNA的原因，可能是不包含被自身限制酶识别的序列，也可能是通过甲基化修饰作用使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化来避免被识别，达到保护自身遗传物质的目的。例如，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中虽然有该限制酶识别的序列，但是该识别序列或酶切位点被甲基化酶甲基化了。当然也并不是说只要甲基化，所有限制酶就都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响实际上有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在的和不可预测的特性。因此，在基因工程中为了有效地切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。

5 基因工程中为通常要使用两种或以上的限制酶的原因，以及不同限制酶的切割特点

基因工程操作步骤剪切目的基因片段和运载体时，通常需要使用两种或以上的限制酶，主要原因是在重组基因表达载体时，必须将目的基因片段“定向”拼接在启动子和终止子之间。另外，使用两种限制酶剪切可以避免载体或目的基因片段的自环化，提高重组效率。考虑到运载体上标记基因的保护、可供选择的限制酶的种类限制等因素，可能需要两种或以上的限制酶分别处理质粒和包含目的基因的DNA片段。

理解清楚以上几个问题后，对于分析与限制酶有关的基因工程等相关题目有很大的帮助。

【例1】某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图2所示。

在构建重组质粒时，应选用_____________两种酶对_____________进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。

解析：考虑到BamHⅠ会破坏目的基因，所以应选用剩余的两种酶：HindⅢ、SalⅠ。从题目信息可以看出，选择两种限制酶可以保证重组DNA序列的唯一性：即可避免质粒的自环化提高重组率，又能保证目的基因的定向连接。

【例2】研究人员将抗盐基因转入普通烟草培育出抗盐烟草，该过程所用的质粒与含抗盐基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图3、图4所示。限制性核酸内切酶BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ、HindⅢ，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓GATCC、T↓GATCA、↓GATC、A↓AGCTT。图5表示该过程中利用含目的基因的农杆菌进行转化作用的示意图。请回答下列问题。

用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，应选用________限制酶切割质粒，选用_______限制酶（一种）切割含目的基因的DNA片段。

解析：在图3中找到启动子和终止子，明确目的基因插入的区段后，对相关限制酶进行判断：若使用HindⅢ处理，会将终止子后面的位置也切断，造成产生的载体片段只包含启动子或终止子，排除；若使用Sau3AⅠ处理，由于其识别的序列↓GATC与BamHⅠ、BclⅠ所识别的序列G↓GATCC、T↓GATCA出现重叠，两种抗生素抗性基因均会被破坏，排除；故而只能使用BamHⅠ处理。在图4中选择一种限制酶切出基因片段有两种方案，HindⅢ或Sau3AⅠ，考虑到质粒经BamHⅠ处理后产生的黏性末端为GATC，与HindⅢ处理后产生的黏性末端AGCT不符，而与Sau3AⅠ处理后产生的黏性末端相同，故只能选用Sau3AⅠ。

从题干信息不难看出，不同限制酶是可以在同一位点进行切割的，如Sau3AⅠ就可以对BamHⅠ或BclⅠ识别的序列进行同位点切割。

本题情景要求分别使用不同种类的限制酶处理质粒和包含目的基因的DNA片段，需要考虑的问题较大，故而难度较大。

6 通过不同限制酶切割结果判断DNA酶切图谱的方法

在已知DNA分子长度的情况下，结合限制酶切割产生的DNA片段长度，判断切割位点的数量；进一步结合两种或多种酶同时处理后产生的DNA片段长度，判断出具体的DNA酶切图谱。

需要注意的是使用一种限制酶处理后若DNA分子长度不变，可能是因为不包含识别序列，也可能切割的是只包含一个酶切位点的环状DNA分子。

【例3】现有一长度为1 000碱基对的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp，用KpnⅠ单独酶切得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子。下图中表示该DNA分子的酶切图谱正确的是 （ ）

解析：由于用限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切后得到的DNA分子仍是1 000 bp，且4个选项中均有EcoRⅠ酶切位点，判断为环状DNA分子，排除A、B选项；用KpnⅠ单独酶切得到4 00 bp和6 00 bp两种长度的DNA分子，说明在环状DNA上有两个KpnⅠ酶切位点，确定选择D选项。可以使用条件用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后得到2 00 bp和6 00 bp两种长度的DNA分子对判断进行检验。

【例4】现有一长度为3 000碱基对的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图6A所示。用酶B单独酶切，结果如图6B所示。用酶H和酶B同时酶切，结果如图6C所示。该DNA分子的结构及其酶切图谱是 （ ）

解析：通过图6A电泳结果可知酶H在该线性DNA分子上只有一个酶切位点，由图6B可知酶B在该线性DNA分子上有两个酶切位点，仅根据这两个结果是无法判断酶H和酶B的切割位点关系的，如图7所示的两种情况都符合要求。

所以用酶H和酶B同时酶切就成为判断两种酶切位点的必要条件。由图6C可知，同时使用两种酶切产生的降解产物为1 400 bp、600 bp、400 bp，可确定为选项A。