张天彬，彭飞燕，吴 瑕，盛囝靖，陈国忠

（1.浙江中医药大学附属杭州西溪医院，杭州 310023；2.广西中医药大学研究生院，南宁 530001；3.东阳市中医院，浙江 东阳 322100；4.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023）

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，抑制结肠癌耐药细胞株的增殖、侵袭、转移且诱导其凋亡是提高临床疗效的关键[1-2]。自研究发现肿瘤多药耐药现象以来，虽几经研究干预治疗，然肿瘤多药耐药所导致的化疗失败，依旧是肿瘤治疗中存在的难点[3]。七方胃痛颗粒对胃恶性肿瘤细胞具有一定的抑制作用，且未见明显毒副作用[4-5]。本研究旨在探讨七方胃痛颗粒对人结肠癌耐药细胞株Caco-2 的影响，为今后七方胃痛颗粒防治结肠癌提供实验依据。

1 材料

人结肠癌耐药细胞株Caco-2 获购于上海慧颖生物科技有限公司，由本实验室传代培养；七方胃痛颗粒方药组成：由红参10 g，白术10 g，生黄芪30 g，茯苓10 g，炙甘草9 g，白芍30 g，炒鸡内金9 g，枳实10 g，木香6 g，黄连6 g，吴茱萸3 g，丹参6 g，免煎中药颗粒（国药准字 Z20123053）由江阴天江药业有限公司生产，广西中医药大学第一附属医院制剂室提供，颗粒被混合搅匀并按每袋8 g 的规格灭菌包装，实验前称取所需剂量药物[6]。实验大鼠20 只，平均体质量（96±10）g，购于湖南长沙天勤生物技术有限公司，饲养于广西中医药大学第一附属医院实验动物房，用于制备药物血清。四甲基偶氮唑盐 （MTT）（sigma,美国）；流式细胞分析仪（美国BD,C6）；流式细胞检测所用的试剂盒（美国BD,556547）；DMEM 高糖培养基及胰蛋白酶（Gibco,1505-065,美国）；全自动酶标仪（Thermofisher,Multiscan FC,美国） ；CO2细胞培养箱（thermo,美国）。

2 方法

2.1 细胞株与菌株的培养 将人结肠癌耐药细胞株Caco-2 置于内含10%的胎牛血清、100 mg/L 链霉素及10 万 U/L 的青霉素DMEM 培养基，放置于CO2浓度为5%的细胞培养箱内培养，箱内设置为37 ℃常温。

2.2 药物血清制备 将大鼠随机分为七方胃痛颗粒药物血清组和空白对照组各10 只，按成人用药体重剂量比值，将中药换算为50 g/kg 的浓度，继而给药物血清组的大鼠灌胃，连续灌服5 d；空白对照组的大鼠则予灌服与药物血清组等体积的生理盐水，连续灌服5 d。灌胃结束后2 h，大鼠腹主动脉采血，分离血清，56 ℃灭活，使用0.22 μm 微孔过滤除菌，分装保存。

2.3 四甲基偶氮唑盐（MTT）法 实验分为5 组，A组：空白对照组，B 组：加入体积分数为2.5%的七方胃痛颗粒药物血清，C 组：加入体积分数为5.0%的七方胃痛颗粒药物血清，D 组：加入体积分数为10.0%的中药药物血清，E 组：加入体积分数为20.0%的中药药物血清。分别作用于细胞株24、48、72 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 液 20 μL，培养箱避光培养4 h 后，每孔加入150 μL 的二甲基亚枫溶液，避光震荡15 min，使结晶物充分融化，并在调至波长为490 nm的酶标仪上测定各孔吸光值（OD 值）。并以下列公式计算细胞抑制率：细胞生长抑制率（%）=（1－实验组OD 值/对照组OD 值）×100%。

2.4 流式细胞术（FCM）实验 在6 孔板中接种耐药细胞株Caco-2，于孔板中孵育24 h 后，各等份Caco-2细胞加入下列组别中，B 组（体积分数为2.5%的中药药物血清）、C组（体积分数为5.0%的中药药物血清）、D 组（体积分数为10.0%的中药药物血清）、E 组（体积分数为20.0%的中药药物血清），另设空白对照组A 组。实验给药方法与MTT 检测相同，培养48 h 后，分别收集各组细胞，用预冷的70%乙醇固定24 h，并用胰蛋白酶消化，收集制成细胞悬液；检测前细胞悬液用 PBS 洗涤2 次，弃上清液，收集细胞沉淀液，加入150 μL RNA 酶A（0.1 mg/mL）和120 μL 碘化丙啶，保持在舒适的室温下避光孵育15 min；然后将细胞悬液混匀，用尼龙膜过滤细胞管过滤去除细胞团块，1 h内上流式细胞仪检凋亡细胞率。

2.5 统计学方法 使用SPSS 16.0 软件对相关数据进行统计学描述和分析，采用单因素方差分析和配对t检验。

3 结果

3.1 七方胃痛颗粒抑制细胞株Caco-2 增殖的作用 见表1。

3.2 七方胃痛颗粒诱导细胞株Caco-2 凋亡的作用 见表2。

表1 七方胃痛颗粒不同浓度药物血清对Caco-2 细胞抑制率的比较（） %

表1 七方胃痛颗粒不同浓度药物血清对Caco-2 细胞抑制率的比较（） %

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与A 组、B 组比较，△P ＜0.05；与A 组、B 组、C 组比较，▲P ＜0.05；与A 组、B 组、C 组、D 组比较，□P ＜0.05

表2 各组人结肠癌耐药细胞Caco-2 凋亡率的比较（）%

表2 各组人结肠癌耐药细胞Caco-2 凋亡率的比较（）%

注：与A 组比较，# P ＜0.05；与A 组、B 组比较，△P ＜0.05；与A 组、B 组、C 组比较，▲P ＜0.05；与A 组、B 组、C 组、D 组比较，□P ＜0.05

4 讨论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,手术和放、化疗虽然是目前治疗该病的主要方法,然而其毒副作用、耐药性等问题尚未得到根本解决[7-8]。中医药治疗恶性肿瘤疗效肯定，毒副作用小，具有整体调节的特点[9]，其治疗机制通过调节脏腑气血，纠正机体阴阳失衡，改善人体内在环境，来达到抗肿瘤的效果[10]。七方胃痛颗粒为全国名老中医罗伟生教授临证治疗胃肠疾病的经验方，由四君子汤、左金丸、逍遥散、丹参饮、枳术丸、枳实芍药散、木香槟榔丸合方而成，主要药物组成为红参、黄芪、茯苓、白术、炙甘草、丹参、木香、黄连、吴茱萸、白芍、枳实、炒鸡内金，具有健脾益气、活血化瘀、清利湿热、理气止痛等功效[11-18]，课题组前期研究发现，七方胃痛颗粒可以抑制人胃癌SGC-7901 细胞的生长[6]。

Li 等研究表明，Caco-2 细胞来源于人体的结、直肠癌细胞，通过诱导Caco-2 细胞凋亡，抑制细胞的增殖，可以达到抗结肠癌的作用及其具有预防癌细胞转移的效果[19]。研究结果表明，七方胃痛颗粒对人结肠癌耐药细胞株Caco-2 有明显的生长抑制作用，并能诱导Caco-2 细胞凋亡，且与药物血清浓度及作用时间呈正相关性。