张建敏，杨康卓，刘 芳，何张兰，彭志云，郑 佳，乔宗伟，赵 东

(宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644007)

浓香型白酒窖内发酵过程是一种多菌种参与的多边反应过程。来自曲药、窖泥及发酵环境的多种微生物（细菌、酵母和霉菌）以酒醅为载体，在白酒窖内发酵过程中进行复杂的物质能量代谢，生成各类代谢产物和风味物质。独特的固态多微酿造工艺赋予了白酒丰富的呈香呈味物质和健康活性功能成分[1-4]。近年来，对白酒微量成分研究结果表明，风味成分的种类和含量都远远超过健康活性功能成分。已有报道中，在浓香型白酒中检出了大量的呋喃类物质（抗氧化、抗癌活性）、苯并呋喃类化合物（抗炎性）、糠醛（杀菌）等[4]，浓香型大曲中检出了吡嗪类（抗氧化、抗癌）、萜烯类（抗癌、抗病毒、抗炎）等[5]。而微生物代谢产生萜烯等健康活性功能成分少有文献报道。

因此，本研究试图从浓香型白酒发酵酒醅中筛选出1 株具有特殊功能的酵母菌，并结合形态学和26S rDNA 测序分析鉴定、顶空固相微萃取-气质联用技术（HS-SPME-GC/MS）分析其菌体及代谢特征，以提高对酵母在发酵过程中的科学认识。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 培养基

种子培养基、增殖培养基：YPD 培养基，购自青岛海博生物技术有限公司。

发酵培养基：五粮粉糖化液制备参考文献[6]。

1.1.2 主要试剂与仪器

Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒SK8259(上海生工生物)；SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒SK8131(上海生工生物)；立式高压蒸汽灭菌锅（YXQ-LS）购自上海博讯实业有限公司；生物安全柜（ESCO Class II），珠海市珠峰仪器仪表有限公司；固相微萃取手柄和50 μm CAR/DVB/PDMS 纤维萃取头，美国Supelco 公司；气质联用仪（7890B GC-5977B MSD）美国Agilent 公司；4-辛醇，GC级，美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株鉴定

1.2.1.1 形态观察试验

对平板划线的单菌落进行形态观察以及显微形态观察。

1.2.1.2 分子生物学鉴定

4)浙江省观光采摘节庆在市级空间上具有数量上和质量上的差异。宁波是各市的典范，金华和台州数量和质量也实现了协调发展，杭州、嘉兴、湖州质量上都要增强从而跟上数量的发展，温州和绍兴应多开发观光采摘节庆，衢州和舟山在数量和质量上都有待提高。

DNA 提取：将菌株3-13 接入增殖培养基中，30 ℃培养7 d，取1 mL菌液10000 r/min离心5 min，弃上清液，收集菌体，按生工生物真菌基因组DNA抽提试剂盒(SK8259)提取DNA，-20 ℃保藏备用。

PCR 扩增：利用引物NL1 和NL4 对酵母菌基因组26S rDNA D1/D2 进行扩增，NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG，NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG。扩增体系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each) 1 μL，DNA 10 ng，引物F(10 μmol/L)0.5 μL，引物R(10 μmol/L)0.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。扩增程序：94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃60 s，共30 个循环；72 ℃10 min，4 ℃终止反应。

26S rDNA 序列测定：利用胶回收试剂盒进行PCR 扩增产物的纯化；纯化产物的测序工作由上海生工生物有限公司完成。

系统发育树构建[7-8]：将所测定的酵母菌26S rDNA 基因序列分别与GenBank 数据库进行BLAST 分析，选取与实验菌株亲缘关系相对较近的标准菌株用Clustalw 软件进行序列比对，采用MEGA 5 软件进行系统发育分析，构建系统发育树。

1.2.2 顶空固相微萃取-气质联用技术分析发酵液风味

1.2.2.1 菌株发酵液培养

将酵母菌株3-13 种子液接种于五粮粉液体培养基中30 ℃静置培养7 d。

萃取头的老化：各类型萃取头在首次使用前均需要在热条件下老化，老化程序参考Supelco 老化指南。

萃取条件：吸取适量发酵液于10000 r/min离心5 min，吸取过0.45 μm 膜的上清液1 mL 加入顶空瓶中，加入50 μL 4-辛醇（10 mg/L）作为内标，置于60 ℃加热振荡器中平衡15 min，萃取头吸附挥发性香气成分45 min，随后插入GC 进样口热解析3 min，分析其中挥发性成分。

1.2.2.3 GC/MS分析条件

GC 条件：DB-Wax（30.0 m 长×0.25 mm 内径×0.25 μm 膜厚，J&W，美国）毛细管色谱柱；进样口温度250 ℃，不分流进样，载气He 流速1 mL/min；升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持15 min。

MS 条件：EI 源，电子能量70 eV；离子源温度200 ℃，四级杆温度150 ℃，质量数扫描范围35～350 amu。

1.2.2.4 化合物鉴定与半定量分析

化合物鉴定采用参考文献[9]所属方法进行化合物定性；单个化合物的相对含量采用其与内标响应值的比进行半定量分析，含量以mg/L表示。

2 结果与讨论

2.1 菌株鉴定

2.1.1 形态观察试验

经观察，菌株3-13 菌落呈蜡状圆形，柔软、光滑、湿润，平板散发有浓厚的酒精发酵气味；显微形态呈球形、椭圆形，大小为0.5～1.5 μm，出芽生殖。见图1。

图1 3-13菌落形态及显微形态

2.1.2 分子生物学鉴定

将菌株26S rDNA 序列与GenBank 上的其他26S rDNA 序列进行Blast 分析，做进化树(图2)比较结果显示，菌株3-13 与Candida pseudohumilisAS 2.3956（FJ888526.1）相似性为99 %，将该菌鉴定为Candida pseudohumilis。

2.2 菌株3-13发酵液挥发性成分分析

本研究利用HS-SPME法提取发酵液中的香气成分，发酵液和空白对照组的色谱图差异较明显（图3）。

图2 3-13菌株系统发育树

图3 菌株3-13主要物质总离子流图

如表1 所示，在菌株发酵液中共鉴定并定量了20 种挥发性成分，其中酯类6 种、萜烯类4 种、芳香族类4 种、醛酮类2 种、醇类2 种、酸类1 种，总含量比例为芳香族类62.61 %、醇类27.52 %、酯类4.36 %、萜烯类2.79 %、酸类2.57 %、醛酮类0.17%。

芳香族类：苯乙醇（69.56 %）、苯酚（0.27 %）、苯甲醛（0.51 %）、2-苯乙酰酯（29.68 %）。芳香族化合物大多数具有典型的花香和甜香味，其中苯乙醇被认为是优质浓香型白酒的主要香味成分之一；酚类物质具有特殊气味，其中苯酚在低浓度时表现为墨水气味，也为白酒中重要的呈香呈味成分。

表1 挥发性成分含量及香气特征

醇类：异戊醇（99.49 %）、3-甲硫基-1-丙醇（0.50%）。异戊醇是白酒中主要的醇类物质，低浓度时具有典型的青草气味。

酯类：己酸乙酯（51.58 %）、庚酸乙酯（6.30%）、辛酸乙酯（13.45%）、壬酸乙酯（7.84%）、癸酸乙酯（16.46 %）、棕榈酸乙酯（4.36 %）均为直链饱和酯，呈现水果味，且大部分在浓香型白酒中已经被检出，其中己酸乙酯含量在总酯中比例为51.58%。己酸乙酯是浓香型白酒的主体呈香呈味物质[1]，且该菌株产己酸乙酯，可以用于制造功能酵母强化曲提高浓香型白酒原酒中己酸乙酯含量。

萜烯类：芳樟醇（13.61 %）、β-金合欢烯（7.87 % ）、γ-壬内酯（4.99 % ）、橙花叔醇（73.60 %）。萜烯类化合物广泛存在于植物中，以异戊二烯为结构单位倍数的烃类及其含氧衍生物，包括单萜烯类、倍半萜烯类以及二萜烯类化合物等。中药材含有大量的萜烯类化合物，这类化合物具有抗癌性、抗病毒以及抗炎症等活性[4]。在酒体中，这些萜烯类化合物不但具有潜在的生物活性成分的功能功效，而且还具有呈香呈味的作用。萜烯类化合物是我国白酒研究中新发现的一类化合物，在药香型、浓香型、酱香型白酒中均有检出[4]。而浓香型白酒中萜烯类化合物的来源于原料、曲药等，而由菌株发酵产生萜烯类化合物少有报道，该菌株所产橙花叔醇含量占萜烯类量的73.60 %，具有一定的研究应用价值。

醛酮类：壬醛（53.76%）、乙偶姻（47.42%），其中乙偶姻为白酒中健康因子四甲基吡嗪的前体物质[4]，四甲基吡嗪是从川芎中分离出来的一种活性成分，具有增加脑血管的血流量等功效。该菌株能代谢产生乙偶姻，对提高浓香型基酒中四甲基吡嗪的含量具有一定的积极作用。

3 结论

本研究从五粮液发酵酒醅中筛选出1 株产香酵母3-13，经形态学和26S rDNA 测序分析鉴定该菌株为Candida pseudohumilis。利用HS-SPMEGC/MS 分析其于五粮粉液体培养基中的代谢风味物质，该菌株不仅代谢出浓香型酒主体香味成分己酸乙酯且同时代谢橙花叔醇、芳樟醇、金合欢烯等萜烯类健康活性功能成分。这对浓香型白酒强化发酵代谢健康活性功能成分、提高白酒健康价值、酵母强化制曲提高浓香型白酒原酒中己酸乙酯含量提供一种新的菌株，也对假丝酵母在发酵过程中的作用有了新的认识。