詹旭莉 汤建华

河北北方学院附属第一医院药学部，张家口，075000，中国

随着 20 世纪30 年代磺胺类药物的临床应用，开启了抗微生物治疗的新时代，抗生素成为治疗细菌感染的有效武器。当细菌接触到抗菌药物，会自发地改变自身代谢途径或产生相应的灭活物质抵抗抗菌药物，从而产生耐药性。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌为革兰氏阴性菌，常位于人体上呼吸道和肠道，引起呼吸道感染、尿路感染和血流感染［1］，是引起医院获得性肺炎的一个原因，且引起感染的多样性和流行病学发生的巨大变化，给临床治疗与预后带来困难，是临床分离和医院感染的重要致病菌之一。自2009 年在印度发现产Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）（被称为超级细菌）至今，美国、德国、日本、澳洲等多个国家和地区已陆续发现该种超级耐药细菌，呈全球蔓延趋势［2-4］。我国“全国细菌耐药性监测网”的数据表明，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）检出率也呈逐年上升趋势，从2014 年6.4% 上升至2019 年10.9%［5］。其中河南省的CRKP 的检出率最高，为53.01%，上海、浙江、江苏、湖北、山西各地检出率达30%以上，现状不容乐观［6］。因此，了解CRKP 的耐药机制对于今后指导临床合理用药越来越重要［7］。

目前临床上使用的抗菌药物，主要包括β-内酰胺类抗生素、大环内酯类及林可霉素类抗生素、氨基糖苷类及多肽类抗生素、四环素类及氯霉素类抗生素、人工合成类抗生素，均在提高患者生存率、缓解症状和改善生活质量方面发挥了巨大作用。然而，近年来随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，碳青霉烯类耐药肠杆菌对药物产生的耐药性也逐年上升。Pulzova 等的研究结果揭示该菌的耐药机制有很多，包括产生超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）、由孔蛋白丢失导致的细菌外膜渗透性改变、主动外排系统表达活跃、产生生物被膜等［8］。现就CRKP 的耐药作用机制分类进行阐述。

1 产碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β内酰胺酶，根据Ambler 分子分类可分为A、B、D 的3 类酶，包括阴沟肠杆菌、黏质沙雷菌中由染色体介导的NMC、SME、IMI 酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC 酶、铜绿假单胞菌中GES 酶，居泉沙雷菌的SFC 酶。KP 主要产生被称为 A 类的丝氨酸酶［9］，介导高水平耐药。B 类酶常见的酶型有IMP、VIM、GIM、SPM、SIM、NDM 等。OXA-48 是D 类酶检出最多的一种，其活性部位具有丝氨酸结构，对亚胺培南的水解能力很强，比OXA-23、OXA-24、OXA-58等其他OXA 型酶高10 倍，同时携带OXA-48 及其他碳青霉烯酶的KP 表现出更高的耐药水平［10］。此外，碳青霉烯酶通常与许多其他耐药决定因素相关，导致多重耐药。

1.1 A 类碳青霉烯酶

A 类碳青霉烯酶以丝氨酸残基为活性位点，其中KPC 酶与CRKP 耐药性密切相关，产KPC 酶的细菌对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等多种抗生素耐药，是目前肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药的主要机制。已发现的KPC 包括KPC-1 至KPC-19 在内的19 种KPC，其中以KPC-2 和KPC-3 最为常见，能够水解除氨曲南以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素［11］，推动了大流行性医院暴发性克隆肺炎克雷伯菌ST258的传播［12］。虽然KPC 酶只能引起KP 对碳青霉烯类抗菌药物的耐药，但有研究发现产生KPC 酶的KP 可能存在异质性耐药。在抗菌药物的选择性压力下，可快速诱导高水平碳青霉烯耐药性，其高水平耐药与抗菌药物筛选出膜孔蛋白基因OmpK36 缺乏的菌株后协同KPC 有关［13］。同时KPC 基因能够凭借质粒传播，使其在不同菌株和菌种间扩散，降低抗感染治疗的成功率。为了避免广谱抗生素的过度使用，仔细选择可接受经验性治疗的患者至关重要［14］。此外，在接受头孢他啶-阿维巴坦治疗的患者体内发现了耐药突变体。产生KPC-2 或KPC-3 的KP 分离株在治疗后10～19 天内出现耐药性，与KPC 酶（R164 至D179）的ω环突变有关［11，15］。最常见的突变是氨基酸位置179（D179Y）的天冬氨酸被酪氨酸取代［16］。这些突变导致头孢他啶水解增强，而阿维巴坦完全抑制这种水解，导致对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性下降。另外KPC 阳性的KP 外膜通透性降低，使其对β-内酰胺类抗生素的耐药程度增强。但Tolentino 等人的研究报道KPC 可与其他耐药基因共同存在同一株细菌而产生高水平耐药，所以需结合检测菌株的遗传背景进行耐药分析［17］。

1.2 B 类碳青霉烯酶

B 类碳青霉烯酶具有独特的水解二价阳离子（最常见的是Zn2+）的机制，主要包括新德里金属β-内酰胺酶（new delhi metallo-β-lactamase，NDM），碳青霉烯酶的IMP 系列，以及维罗纳整合子编码的金属β-内酰胺酶（VIM）。携带NDM-1 基因的细菌具有极强的耐药性，对所有的抗菌药物几乎都有抗药性。NDM-1 的活性位点具有特殊功能，其独特的氨基酸残基的立体折叠结构能够与碳青霉烯药物获得更加紧密的结合，使其耐药性更强［18］。到2010 年，NDM-1 已在大肠杆菌的染色体内被检测到［19］，而且这种基因还有可能通过“基因水平转移”这一机制在不同种类的细菌间传递，从而使得其他细菌也可以获得这种基因，产生相同的耐药性［20］。这些酶水解多种β-内酰胺类抗生素，但不能水解单环β-内酰胺类抗生素，如氨曲南。

我们发现所有NDM-1 基因都可以通过转化和接合成功转移，而KPC-2 基因的转移仅通过接合。对这一发现最合理的解释是，NDM-1 携带可自我传播的IncA/C 或IncP 质粒，而KPC-2 位于非自我传播的质粒上或染色体上［21］。

1.3 D 类碳青霉烯酶

D 类为青霉素酶，对青霉素的水解效率很高，但对碳青霉烯类的水解能力较弱，且不含广谱头孢菌素，其中 OXA-48 与碳青霉烯类耐药密切相关。目前为止，在非洲、中东和欧洲，特别是在地中海地区，已经清楚地记录了含OXA-48 的病原体的逐渐扩散对世界其他地方是一个巨大的威胁［22］，且报道逐渐增多。据报道，在2014～2015 年期间，这些菌株在土耳其的数量很多［23］。92%的肠杆菌科耐药是由OXA-48 引起的。可能是由于产β-内酰胺酶的菌株活化或改变了 OXA-48 的表达，产 OXA-48 菌株对碳青霉烯类药物的敏感性降低，也可能是由于外膜通透性降低，从而对碳青霉烯类药物具有一定的水解活性［24］。OXA-48 基因的传播主要与62 kb 的单个IncL/M 型自转移质粒的传播有关［25］。单独的OXA-48 样碳青霉烯酶可诱导较弱的青霉素和碳青霉烯水解，但不会诱导头孢菌素。因此，它们可能更难检测，并被称为“幻影威胁”。当发现这些酶与其他β-内酰胺酶（如ESBL）结合使用或当孔蛋白变化导致通透性降低时，可能发生高水平的碳青霉烯抗性。

2 外膜孔蛋白的缺失

外膜孔蛋白是一种存在于革兰阴性菌细胞外膜的脂多糖层上的水溶性扩散通道，主要包括OmpK35、OmpK36。抗生素可通过这些孔道进入细菌体内发挥抗菌作用。染色体上主要外膜孔蛋白OmpK35 和OmpK36 的修饰可降低外膜对药物的渗透性，限制了作用于CRKP 的抗生素透过外膜的流入［26］。这是通过插入胞嘧啶核苷酸推断出来的，这会导致翻译移码，从而在第89 位密码子截断蛋白质。外膜孔蛋白缺陷降低了对β-内酰胺类药物的敏感性，并与β-内酰胺酶结合，抗生素无法通过这些孔道进入细菌体内，进而降低了抗菌药物的敏感性，从而出现耐药性［27］。OmpK36孔蛋白的缺失会显著影响KP 的代谢适应性，较慢的生长速度可能会使其更容易被免疫系统在体内消除［28］。

Turner 等的研究表明，在感染期间，OmpK36 主要在炎症反应中起作用［29］。遗传多态性显示KP 分离株可分为4（A、B、C 及D 型）个主要的OmpK36 孔蛋白变异体［30］。并且，在这4 种分型中，C 型分离株比非C组分离株具有更高的高粘血症发生率，因此C 组最有可能与黏液样分离株相关，主要包括荚膜血清型为K1、K2 和K5 分离株，以及大多数K57 分离株。然而K20血清型在OmpK36 非C 组分离株中比在OmpK36 C组分离株中更普遍［28］。OmpK36 C 组分离株对几乎所有抗菌药物的耐药率明显低于OmpK36 组非C 组分离株。

3 外排泵作用的增强

外排泵存在于几乎所有的细菌的染色体上，并且通过促进位点突变和改变膜的通透性，降低细胞内抗生素浓度进而产生耐药［31］。外排泵系统的表达是该菌产生耐药性的重要机制之一。目前为止，发现7 类细菌药物外排泵［32］。Sheng 等的研究报告表明，外排泵的表达增加，例如AcrAB 和OqxAB 在替加环素治疗KP 的抗性机制中发挥重要作用［33］。已证实AcrAB外排泵受RamA 和SoxS 调节，OqxAB 受RamA 和RarA 调节，KP 的外膜蛋白TolC 受所有这些调节物控制［34］。

3.1 AcrAB-TolC 外排泵

AcrAB-TolC 复合体主要由外膜通道蛋白TolC、内膜转运蛋白AcrB 和膜融合蛋白AcrA 组成［35］。有研究报告证实，转运蛋白能从细胞周质或者从细胞质膜外层直接捕获底物，融合蛋白通过连接外层通道和内层泵进行外排［36］，当细菌中转运蛋白过量表达时，细菌就会通过物质转运泵将抗生素排出。其中AcrABTolC 系统与青霉素和头孢菌素等β-内酰胺类抗生素的耐药性有关，AcrAB 外排泵的过度表达是导致某些菌株对抗生素敏感性下降的原因［37］，如厄他培南和美罗培南。AcrAB 能够识别多种底物（喹诺酮类、大环内酯类、四环素和β内酰胺类等多种抗菌药物），这些抗生素与TolC 结合可增强细菌对抗生素的外排作用［38］。

AcrAB-TolC 泵可由RamA、SoxS、RarA 等基因激活。RamA 是AcrAB-TolC 外排泵转运蛋白的激活剂，通过调节外排泵以增强KP 对β-内酰胺类药物的抗性，其过表达还能导致靶位点的突变或孔蛋白的丢失以致KP 产生耐药［39］。RamA 不仅可以降低KP 对替加环素的敏感性，还能促进AcrA 过表达以增强对氟喹诺酮的耐药性［40］。与RamA 一样，SoxS 的过量表达与编码外排泵AcrAB 基因的转录水平增加有关，从而提高对头孢西丁、喹诺酮类药物和氯霉素的耐药性［34］。RarA 通过上调AcrAB、AcrCD 和AcrEF 外排泵和下调OmpF孔蛋白赋予肺炎克雷伯菌耐药性。通过比较过量表达RamA、SoxS、RarA 这3 种调节因子对包膜通透性、外排泵和孔蛋白产生以及KP 的抗生素敏感性的相对影响，发现RamA 是KP 中最有效的包膜通透性调节剂，其次是RarA，最后是SoxS［34］。负向调节因子RamR、SoxR、AcrR 通过下调AcrAB 的表达以恢复KP 对药物的敏感性。RamA 的阻遏基因RamR 参与了KP 中AcrAB 表达的调节，通过抑制AcrB 和RamA 的过度表达，恢复KP 对替加环素的敏感性［41］。而SoxR 基因能抑制SoxS 的过度表达，因此，RamR 和SoxR 基因调控KP 外排系统的表达［42］。导致AcrAB 外排系统过度表达的原因是AcrR 密码子45 位氨基酸突变，精氨酸取代半胱氨酸，并导致多重耐药［43］。总的来说，RamA、SoxS、RarA 参与了抗生素敏感性的改变，并导致新陈代谢和细菌适应性的变化。

3.2 RamA-OqxAB 外排泵

RamA 是调节抗生素敏感性最重要的基因。OqxAB 是近几年发现的KP 固有的一种较新的外排泵系统，对多种不同类别的底物都能表现出一定的外排作用［44］。OqxAB 基因的过度表达导致对多种药物（喹诺酮、替加环素、呋喃妥因和氯霉素）、洗涤剂和消毒剂产生耐药性［45］。RarA 的过表达可以上调其下游外排泵操纵子OqxAB 和AcrAB 的表达水平［46］。在KP 临床分离株的OqxR 上发现的一个新的氨基酸替代物也能诱导OqxAB 和RarA 的高表达［47］。这种质粒携带的多药外排泵可能会造成耐药性问题，因为它可能会促进多种药物的耐药性发展，并通过水平转移传播耐药性。

4 生物被膜

生物被膜是细菌附着在生物材料表面，由于过度生长而形成的细菌复合体，是非特异性细菌耐药机制之一。主要成分包括细菌及其分泌的多糖基质、脂蛋白等。CRKP 生物膜的发展经历了四个阶段，分别是细胞的黏附、菌落的形成、成熟以及最终繁殖成为自由生存的细胞。参与形成过程最重要的表面结构是Ⅲ型菌毛和荚膜多糖［48］。菌毛介导稳定的黏附，而荚膜多糖最终影响生物膜的结构和细胞间的通讯。生物膜形成的过程中，受到动力学和环境变化的刺激，细菌必须具有迅速而广泛地改变基因表达的能力［48］。CRKP 的某些特定基因的突变也会影响生物膜的功能。Mostafavi等人发现fabZ 和IpxC 突变导致IpxC 抑制剂依赖的细菌生长，从而导致生物膜稳态丧失［49］。Hsieh 等报道YfgL（BamB）脂蛋白参与CRKP 的生物膜形成过程和Ⅰ型菌毛的转录表达，这对于体内CRKP 的抗吞噬作用至关重要［50］。此外，Saurel 等的报道，发现CRKP 的外膜蛋白A（KpOmpA）参与细黏附和细胞间识别以及宿主的免疫反应，且表面的L3 位点可能与CRKP 的致病性有关［51］。氧化应激可能氧化并破坏CRKP 的生物膜，导致主要膜蛋白的缺失［52］。上述相关研究表明，CRKP 的生物膜是维持其活性的关键条件之一。

细菌一旦形成生物被膜，则会增加活菌对机体的免疫并产生抗生素耐药，这直接提升了膜内细菌的存活率。CRKP 的生物被膜只有氨苄西林和环丙沙星两种抗菌药物能通过，碳青霉烯类抗菌药物通透性差。对CRKP 浮游菌和生物被膜细菌同时进行灭菌，最终细菌消灭率分别为91%～93.5%和25%～26%。

5 结论

综上所述，CRKP 因具有多种基因结构和复杂的耐药机制而在全球范围内广泛传播并呈增加趋势。耐药基因可通过细菌间的质粒或染色体进行水平或垂直传播，大大增加了检测的难度。因此需要临床微生物实验室构建成熟完备的耐药基因检测系统，以便及时准确地反馈信息并制定合理的给药方案。复杂的耐药机制导致CRKP 对常用抗菌药物产生广泛耐药，临床常常面临无药可选的窘境。临床治疗药品品种有限，上市的新药头孢他啶联合阿维巴坦治疗经验有限，治疗费用昂贵，大部分人不可获得，限制了其广泛应用，导致该类细菌感染患者陷入无药可用的困境。近年来，使用双碳青霉烯类联合治疗CRKP 成为一个新的方向，其原理是利用一种碳青霉烯类药物结合耐药基因，另外一种碳青霉烯类药物发挥抗菌作用。目前还处于基础研究阶段，已经取得了一定成果。