焦 蓉 何鹏飞 王 戈 吴毅歆 王军伟唐 萍 杨焕文 何月秋

(1云南农业大学,云南 昆明 650201;2微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心,云南 昆明 650201;3红塔烟草(集团)有限责任公司,云南 玉溪 653100)

内生菌指整个生活史或某个阶段生活于植物体内并对植物无不利影响的微生物的总称,其与植物组成一个稳定的自然生态系统,对植物的生长发育和抗病抗逆等过程产生重要的影响[1-2]。内生菌在植物内的存活和定殖是其发挥防病和促生作用的前提条件[3-4]。目前用于检测内生细菌在植物体内定殖的方法包括抗生素标记法、基因标记法、同位素示踪法、DNA和RNA 探针法、免疫学方法等[5]。报告基因技术的发展为研究目标微生物与寄主间相互作用及其分布定殖规律创造了非常有利的条件[6]。绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)具有标记基因片段小,结构稳定,操作简单,无毒无害,激发荧光不需要外源底物和能量,在多种生物细胞中均可表达应用等优点[7],是近年来应用最广泛的标记分子之一。

由二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)引起的烟草白粉病是烟草生产过程中一种主要的叶部真菌病害,其分布范围广且发病快速,特别是在育苗期间的温室大棚内,相对高温高湿环境使白粉病菌在大棚内迅速扩展,对烟草生产构成了严重威胁,并在后期影响烟草的产量和品质[8]。目前生产上烟草白粉病防治主要以化学防治为主,化学防治虽能在一定程度上控制白粉病,但过多依赖化学药剂会产生病原菌抗药性、农药残留和环境污染等问题。而通过筛选新的生防因子来防控植物病害不但可以减轻病害,还能促进生态平衡,是目前植物病害防治研究的热点[9-10]。解淀粉芽孢杆菌YN201728是一株分离自烟草种子的内生菌,前期研究证实此菌株能有效防控烟草黑胫病和促进植株生长,并对多种真菌病害有较强的拮抗活性[11]。为了充分利用生防菌防治烟草白粉病,本研究采用YN201728 菌液喷施烟草幼苗,以期进一步明确其防治效果与定殖量之间关系,为开发生物农药产品提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:烟草内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN201728(以下简称YN28),由云南农业大学植物病虫害生物防治实验室自烟草种子中分离。其荧光标记菌株YN28-P43GFPmut3a(以下简称YN28-GFP)为自然转化[12]所得的菌株。

供试烟草:供试烟草品种为云烟87,种子由云南省烟草农业科学研究院提供,烟苗在育苗基质中培育至4～5片真叶备用。

培养基:细菌培养采用LB 培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 YN28-GFP 标记菌在烟草组织及根际土壤的定殖能力测定

1.2.1.1 浸种对YN28-GFP 标记菌在烟草幼苗植株内定殖数量的影响 将烟草种子置于75%(v/v)酒精浸泡2 min 作表面消毒处理,无菌水漂洗3次以去除残余酒精。随后转入荧光标记菌的细胞悬浮液(1.0×107CFU·mL-1)内浸种24 h,最后全部移入含有无菌湿润滤纸的培养皿(9.0 cm)内,28℃光照培养箱黑暗萌发。待种子萌发后,将培养箱的光照条件改为16 h光培养和8 h 暗培养。

浸种处理15 d后,称取0.1 g 烟草幼苗组织并置于5 mL 灭菌离心管中,用灭菌玻璃棒捣碎成匀浆状,10倍梯度稀释,取适合的梯度倍数稀释液均匀涂布于含氯霉素(10 μg·mL-1)的LB 培养平板,37℃倒置黑暗培养24～36 h,随后在WD-9403F型紫外分析仪(北京六一仪器厂)照射下统计平板上发绿色荧光的菌落数,计算荧光菌在幼苗中的定殖量。试验设3次重复。

1.2.1.2 浇灌对YN28-GFP 标记菌在烟草组织及根际土壤定殖数量的影响 将育苗基质中培育至4～5片真叶的烟草幼苗移栽至装有自然土200 g/盆的盆钵(10 cm×10 cm×12 cm)中,1株/盆。移栽10 d后,向每株烟草根基部浇施10 mL YN28-GFP 标记菌的菌液(1.0×107CFU·mL-1),分别在浇施接种后的第1、第5、第10、第15、第25、第30、第40、第50天从烟草组织和根际土壤处取样,每个处理取3个重复。具体取样及后续稀释涂布等细节参考何鹏飞[13]的方法。取样后测定标记菌在烟草组织及根系周围土壤中的定殖情况。

1.2.1.3 YN28-GFP 标记菌在烟草组织的定殖情况 在浇施荧光标记菌后的第5天取烟草组织并对其作表面消毒,无菌水冲洗组织表面3～4次,切取烟草种子、根、茎、叶等组织并用压片法制片,以未浇施标记菌的烟草植株为对照,在激光共聚焦显微镜(Leica SP5Ⅱ,德国莱卡)下观察YN28-GFP 标记菌株的定殖情况。激光共聚焦显微镜的激发波长设置为488～633 nm,在510～560 nm 波长处收集发射光以观测YN28-GFP,在620～660 nm 波长处收集发射光以获取荧光背景。

1.2.2 菌株对温室烟草白粉病的防效测定 试验在云南农业大学植物保护学院温室中进行,烟草植株的育苗及移栽同1.2.1.2。

保护性试验流程:向烟草叶片分别喷施野生型菌株和标记菌株发酵液(1.0×107CFU·mL-1),10 mL/株,喷施1次;分别以喷施等体积的无菌LB 培养基和50%嘧菌酯水分散粒剂10 000倍液为阴性对照和阳性对照,喷施前各药剂加入0.1%(v/v)吐温20。待上述各处理液在烟草叶面上干燥后,再向叶片抖落接种白粉病孢子,然后将烟草幼苗移入温室,正常水分管理。在接种生防菌后的第3、第7、第14、第21和第30天分别按烟草病虫害分级及调查标准[14]调查各处理白粉病发病情况,计算病情指数和相对防效;观察新生叶片的发病情况,分析各处理对白粉病的持效期。每处理设3个重复,每个重复15株。

治疗性试验流程:先接种白粉病孢子,待烟草叶片初现白粉病斑,调查病情后,向烟草叶片分别喷施生防菌株及对照试剂,其他操作步骤同保护性试验。

1.2.3 YN28-GFP 标记菌在烟草叶际和叶内的定殖能力测定 标记菌在烟草叶际的定殖能力:分别从1.2.2 保护性试验和治疗性试验所喷施标记菌株处理的烟草幼苗中,在培养第3、第7、第14、第21和第30天时随机采取烟草叶片,每个重复取1片烟叶(倒三叶),3次重复。叶片称重后用无菌水冲洗5次(避开取样时叶片留下的伤口),合并收集洗脱液,4 000 r·min-1离心20 min,保留沉淀,经无菌水梯度稀释后涂于含氯霉素平板上,37℃培养过夜后计数。根据每皿中的菌落数量,计算每克鲜叶片的叶际所含菌量。

标记菌在烟草叶内的定殖能力:取样方法同上,烟草叶片表面彻底消毒后,研磨稀释涂布于含氯霉素的LB 平板上,统计荧光菌的定殖量。根据标记菌的定殖量评估YN28 菌株在烟草叶片的定殖能力,并结合生防菌的相对防效分析拮抗菌的定殖能力与其防治效果的相关性。

1.2.4 数据分析 采用SPSS 17.0 软件进行数据的方差统计分析,多重比较使用Duncan′s 新复极差法进行多组样本间的差异显著性检验,以P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 YN28-GFP 标记菌在烟草组织及根际土壤的定殖情况

2.1.1 YN28-GFP 标记菌在烟草幼苗中的定殖 从YN28-GFP 菌液处理的种子长出的烟草幼苗中回收到大量荧光菌落,菌落数达到2.18×106CFU·g-1,推测标记菌不但进入种子内部,而且在种子萌发生长过程中可繁殖。

2.1.2 YN28-GFP 标记菌在烟草根际土、根表土及组织中的定殖 由图1可知,接种YN28-GFP 1 d后,在烟草根、茎、叶和根表土中回收到的YN28-GFP 标记菌菌落数分别为6.00×105、9.90×105、2.10×104和1.17×106CFU·g-1,且根、茎和根表土的定殖量达到最大值,说明该内生菌在烟草体内的移动速度很快;根际土中YN28-GFP 标记菌含量在接种前5 d 处于缓慢增长状态,在接种第5天时达到最大值,而叶中YN28-GFP标记菌含量在接种第10天才达到最大值。随着接种时间的延长,YN28-GFP 标记菌株的定殖密度有所下降。从接种第15天开始,根际土和根表土中菌落数开始大幅度下降,接种第20天时茎和叶中的YN28-GFP标记菌含量也开始下降,而根中YN28-GFP 标记菌含量从接种第30天才开始以数量级形式大幅下降。接种第50天时,烟草根、茎和叶组织中仅分别回收到6.30×103、2.0 ×102、1.0×102CFU·g-1的菌落。根表土中YN28-GFP 标记菌的定殖量始终高于根际土,说明根系分泌物中的某些成分可能具有引诱细菌定殖和增殖的作用。

接种第5天,经荧光菌处理的根表及木质部导管呈现出很强的绿色荧光(图2-A),而对照烟草根系中未见荧光(图2-B);在茎的横切和纵切切片中,YN28-GFP 主要聚集在茎表皮、韧皮部和维管束组织等部位(图2-C、E),在叶肉细胞间隙及表皮中也可观察到荧光踪迹(图2-G);在烟草种子的表皮及种胚内同样可以观察到荧光菌(图2-Ⅰ)。由此可见,标记菌YN28-GFP的定殖主要聚集在烟草的根表皮、木质部导管,茎表皮、韧皮部及维管束组织,叶表和叶肉细胞间隙以及种皮与胚等部位。

2.2 菌株定殖与烟草白粉病防效间的关系

2.2.1 拮抗菌株对温室盆栽烟草白粉病的防治效果 保护性试验结果显示(表1),未提前喷施生防菌的阴性对照组在处理第3天开始发病,而菌液处理组(YN28、YN28-GFP)和阳性对照组均未发病;处理第7天时,野生型YN-28和标记菌株YN28-GFP 组的防效分别达到81.79%和78.51%,且两者的防效与阳性对照组无显著差异;处理14～21 d时,菌液处理组的防效开始下降,但其病情指数显著低于阴性对照,处理第21天时,菌液处理组YN28和YN28-GFP的防效分别降至35.37%和38.69%,此时生防菌的防效已明显低于药剂处理的阳性对照;处理第30天时,菌液处理组烟草的病情指数与阴性对照组无显著差异,说明菌液处理组基本失去防效,菌株YN28和YN28-GFP 对烟草白粉病的保护作用持效期约21 d。

治疗性试验结果显示(表1),生防菌(YN28和YN28-GFP)处理对烟草白粉病有明显的治疗作用,野生型菌株YN28和标记菌株YN28-GFP处理14 d时对烟草白粉病的治疗效果最好,防效分别达到76.97%和74.33%,且与阳性对照组无显著差异;处理21 d后菌液处理组(YN28、YN28-GFP)的烟草白粉病防效开始降低,但病情指数仍显著高于阴性对照;处理第30天时,菌液处理组的病情指数与阴性对照间均无显著差异,失去了防效作用。

综上所述,野生型菌株YN28和标记菌株YN28-GFP 在不同时间点对白粉病的防治效果均无显著性差异,因而荧光标记对菌株的生防效果未产生明显影响。

2.2.2 YN28-GFP 标记菌在烟草叶际和叶内的定殖能力与防效关系 通过组织分离培养法测定标记菌株YN28-GFP 在烟草叶际和叶内的定殖量。由图3可知,无论是保护性试验还是治疗性试验,处理14 d 内烟草叶际和叶内菌量均维持在105～106CFU·g-1,烟草叶际菌含量略高于叶内。随着处理时间的延长,YN28-GFP 在烟草叶际和叶内的总定殖量逐渐降低,结合2.2.1 中YN28-GFP 标记菌对白粉病的防治效果可知,标记菌的防效也随着处理时间的延长相应降低;处理第30天时,治疗性试验和保护性试验结果均显示,标记菌YN28-GFP 基本失去防效,其中,保护性试验中烟草叶片标记菌YN28-GFP的定殖量仅有102～103CFU·g-1,推测拮抗菌在烟草叶片中的定殖能力与防效密切相关。

3 讨论

本研究采用荧光标记菌株YN28-GFP 观察其在根围土壤中的定殖情况,发现不同时间点烟草根表土的标记菌含量始终高于根际土,这可能是由于烟草根系可分泌如糖类、有机酸及氨基酸等小分子物质,而这些成分既可作为细菌的营养源,又可改变土壤微环境而触发微生物的趋化性,进而影响微生物的定殖状态[15]。定殖后的内生菌并非处于静止状态,而是在植物的不同部位相互转移,YN28-GFP 发酵液浇灌烟草植株1 d后,就能在烟草的根、茎、叶等组织中检测到标记菌,荧光标记主要聚集在烟草根表皮和木质部导管,茎表皮、韧皮部、维管束组织以及叶肉间隙等部位,与前人发现的芽孢杆菌在烟草上的定殖规律相似[16-18],表明菌株浇灌到烟草根系附近后,根系分泌物可以吸引菌株迅速向根表移动聚集,定殖于根的分生区、伸长区、成熟区以及主根和侧根连接处等部位[4],利用植物的吸水动力,通过木质部导管的质外体转移到植株的茎和叶等其他组织[19]。同时,研究认为细菌在植物根系及其他组织的定殖与细菌的趋化性、鞭毛运动、植物细胞壁降解、活性氧清除能力以及生物膜形成等因素密切相关[20]。浸种处理的烟草幼苗中标记菌定殖量也能达到106CFU·g-1,种子的种皮和胚中都能检测到标记菌株,推测内生菌可能通过自然孔口直接进入种子。Coombs 等[21]用egfp基因标记的丝状链霉菌检测其在萌发小麦种子中的定殖情况,发现在小麦种子的胚、胚乳和胚根中就能观察到内生菌的定殖,说明内生菌定殖种子内可能从植物的根、茎、叶、花等部位侵入后转移到种子中,侵入也可能发生在植物发育的最早期阶段,直接从皮孔等部位进入种子长期定殖[22],也可能在种子的不同世代垂直传播[23]。

烟草白粉病是一种严重的真菌性气传病害,扩增迅速且极难防治和根除。本试验研究了喷施生防菌YN28 对温室盆栽烟草白粉病的防治效果,发现YN28-GFP 对烟草白粉病有较好的保护和治疗效果,处理14 d时,保护性试验和治疗性试验中YN28-GFP的防效分别达到66.96%和76.97%。彭志荣等[24]、刘邮洲等[25]研究发现生防菌对病原菌的保护效果好于治疗效果,即提前接种拮抗菌株定殖能力强、防效好。本研究中治疗性试验的防效稍优于保护性试验,可能是治疗性试验中阴性对照起始病情指数偏高(21.73)的原因;处理30 d时,保护性试验和治疗性试验中阳性对照的相对防效仍分别高达84.55%和77.88%,可能是因为本试验设计的农药浓度高于一般使用浓度。无论是保护性试验还是治疗性试验,50%嘧菌酯水分散粒剂的持效期都显著优于生防菌(YN28、YN28-GFP)处理,而生防菌在无保护的条件下,在处理30 d时已基本失去防效。但生防菌研制成为制剂时,一般要加入不同保护功能的助剂,避免菌体数量过早衰减,从而延长其防效。在实际田间应用中YN28 制剂的持效时长还有待进一步深入研究。

定殖能力强弱直接关系到生防菌能否适应自然环境条件,能否发挥促生防病作用,能否被开发为生物农药,是生防菌发挥生防能力最重要的因子之一[26]。内生菌YN28 在烟草体内具有良好的定殖能力,白粉病温室盆栽试验前21 d,标记菌在叶际和叶内定殖量达到105～106CFU·g-1,说明YN28 具有作为生防菌的基本特征。定殖是生防菌发挥防效的关键步骤,Chin-AWoeng 等[27]构建了绿针假单胞菌PCL1391 菌株运动基因的突变体,与野生型相比,定殖能力缺失的突变体菌株彻底失去了防治番茄猝倒病的能力。Cao 等[28]将枯草芽孢杆菌SQR9 制成生物有机肥可有效防控黄瓜枯萎病,GFP 标记菌可在黄瓜根的分化区和伸长区、根毛和侧根连接处稳定定殖,保护宿主免受病原体侵害。本研究发现,随着处理时间的延长,标记菌YN28-GFP 在烟草叶际和叶内的定殖量逐渐减少,白粉病的防治效果也逐渐降低,定殖量与生物防治效果呈密切正相关。为更好的发挥生防菌的防病作用,在实际应用中,可以将菌株制备成含生防菌的有机肥或土壤改良剂等制剂[29],保护好菌株的生存环境,同时可根据大田发病情况适当补施。

4 结论

本研究利用绿色荧光标记的内生菌开展定殖与防治白粉病研究,结果表明,标记菌YN28-GFP 在烟草根围及幼苗中的定殖密度表现为根表土＞根际土＞根＞茎＞叶;激光共聚焦显微镜观察显示,标记菌YN28-GFP主要聚集在烟草根表皮、木质部导管、茎表皮、韧皮部及维管束组织、叶片表面和叶肉细胞间隙以及种子的种皮与胚等部位。野生型YN28和标记菌株YN28-GFP 对烟草白粉病有较好的保护和治疗效果,烟草叶片中内生菌的定殖量与其防效密切相关。总之,内生菌YN28可在烟草体内有效定殖并在叶际及叶内维持一定浓度,为进一步利用该菌株开展烟草白粉病的防控提供了理论基础。