朱宗文 田守波 杨学东 张 辉 张永平

(上海市农业科学院设施园艺研究所/上海市设施园艺技术重点实验室,上海 201403)

辐射诱变是培育作物新品种及创制新种质的一种有效方法,常用的诱变源包括60Co-γ射线、紫外线、X射线和激光等[1-3]。自20世纪90年代以来,电子束辐照已成为诱导植物变异的一种新方法。电子束辐照诱变育种是利用电子加速器产生的电子束处理植物种子、花粉或者植物幼苗等,从而诱导植物发生变异。电子束辐照技术能量利用率高且操作简单[3-4],已在多种作物的诱变育种中得到较广泛的应用。如,黄强等[5]用电子束辐照玉米自交系,获得了较丰富的遗传变异;林祖军等[6]用不同剂量的电子束辐照菊花组培苗、唐菖蒲及百合种球,3种花卉在花期和花色等方面都发生了一定的变化;张容等[7]用电子束处理小麦干种子,小麦产生了丰富的变异类型;许竞早等[8]利用高剂量电子束处理酒精酵母菌株筛选出耐高温的菌株。目前,在番茄(Solanum lycopersicum)诱变育种中,利用电子加速器进行辐照的报道较鲜见。上海市农业科学院番茄育种课题组曾利用电子束辐照处理番茄种子,发现电子束会降低种子发芽率,并对植株生物量的累积和生长形态造成一定的影响[9-11]。但是上述研究未分析电子束辐照后幼苗体内的理化性质,且无品种间的比较。

植物在遇到逆境时会发生一系列的生理变化,如改变渗透调节和增强抗氧化酶活性等[12-13],从而减少逆境对遗传物质的损伤[14]。本研究选用两个番茄品种的干种子,用不同剂量的电子束进行处理,分析辐照后种子的发芽率、发芽指数和活力指数,并进一步分析M0幼苗体内的生理生化特性,了解电子束辐照对番茄生理特性的影响,以期为电子束诱变技术应用于番茄及其他作物的诱变育种提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

番茄品种:黄盆栽和1479,两品种的种子在2008年同一批次收获,由上海市农业科学院提供。

预试验结果证明,同一批次的番茄种子发芽率相同,且发芽整齐度一致。

1.2 辐照处理试验

将以上两个番茄品种的干种子分别装入牛皮纸袋,用电子束进行辐照处理,辐照剂量分别为200、300、400、500、600 Gy,以未辐照种子为对照。每个处理100粒种子,设3次重复。电子束处理试验由上海市农业科学院束能辐照技术有限公司利用日本IHI公司生产的ESS-010-03型电子直线加速器进行操作,额定能量10 MeV,功率10 kW。

1.3 种子发芽试验

将经过辐照的种子和对照种子一起在恒温生化培养箱内进行发芽试验,每个处理100粒种子,设3次重复。在透明塑料发芽盒(12 cm×12 cm×5 cm)内铺2层发芽纸,把种子放在发芽纸上,保持恒温25℃。从培养第3天开始,到第14天为止,每天统计发芽种子数和幼苗生长情况。各项发芽指标计算公式如下:

式中,Nt表示在td时的发芽种子个数;Dt表示相应的发芽天数;N表示种子总数;H表示发芽终期幼苗的高度,cm。

1.4 播种和定植试验

将每个处理约100粒种子分别播种到无孔穴盘内,待植株长出真叶时,在不同处理间选取长势较好、生长相对一致的植株移植于32 孔穴盘。每个处理32株。无孔穴盘所用基质为草炭∶蛭石=2 ∶1(v/v)。

1.5 番茄幼苗各项生理指标的测定

待番茄幼苗长出6～8片叶时,选取植株上部3～5片新鲜叶片,称取0.2 g。把叶片洗净后置于预冷的研钵中(-20℃),加入2 mL 预冷(-20℃)的磷酸缓冲液(0.05 mol·L-1,pH值7.8),在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中,低温(4℃) 12 000 ×g离心20 min,取上清液用于抗氧化酶活性的测定[14]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定采用氮蓝四唑(nitrogen blue tetrazole,NBT) 法[15],过 氧 化 物 酶(peroxidase,POD)活性测定采用愈创木酚法[15],过氧化氢酶(catalase,CAT)活性测定采用紫外吸收法[16]。

对于辐照处理,选取生长发育较典型的植株,取自上向下数第4片完全展开叶测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)、游离脯氨酸(proline,Pro)、可溶性糖和可溶性蛋白质的含量。采用硫代巴比妥酸法(thiobarbiturate,TBA)[15]测定MDA含量,考马斯亮蓝G-250 法测定可溶性蛋白含量,蒽酮比色法测定可溶性糖含量,磺基水杨酸法测定Pro含量[17]。以上每项生理指标的测定,每处理均设3次重复。

1.6 统计分析

用SPSS 16.0 统计软件和Microsoft Office Excel 2007进行数据统计及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 电子束处理对番茄种子萌发的影响

黄盆栽和1479的干种子经电子束辐照后,其发芽率、发芽指数(Gi)和活力指数(Vi)都发生了变化,但是电子束对两品种番茄种子的影响不完全相同(表1)。对于1479,当辐照剂量为200和300 Gy时,其发芽率与CK 无显著差异,当辐照剂量达400 Gy后,其发芽率开始显著下降,而当辐照剂量达到600 Gy时,种子发芽率仅为CK的77.2%;同时,1479的Gi和Vi都随着辐照剂量的增加而降低,辐照剂量达到300 Gy时,Gi和Vi均显著低于CK;辐照剂量为600 Gy时,Gi和Vi分别为8.4和11.6,仅分别为CK的38.0%和10.2%,且Vi下降幅度大于Gi,这主要是因为辐照处理严重抑制了胚芽和胚根的生长。而对于黄盆栽种子,当辐照剂量为200～600 Gy时,其发芽率与CK均无显著差异;当辐照剂量为200～400 Gy时,黄盆栽种子的Gi和Vi均显著高于CK,而辐照剂量达到500～600 Gy时,黄盆栽种子Gi与对照无显著差异,Vi开始显著低于CK,且随着辐照剂量的增加而快速降低。上述结果表明,番茄种子发芽率会随着电子束辐照剂量的增加而降低,且两个番茄栽培品种对电子束敏感性不同,1479 较黄盆栽更敏感。

2.2 电子束处理对番茄幼苗叶片渗透调节物质的影响

由图1可知,1479和黄盆栽的种子经电子束处理后,其幼苗叶片内的可溶性蛋白含量明显增加,且随着辐照剂量的增加而增加。但2个番茄品种对电子束的反应不同。对于1479,当辐照剂量为200 Gy时,幼苗叶片中可溶性蛋白含量显著下降,仅为CK的30.77%,继续增加辐照剂量,其可溶性蛋白含量缓慢上升,当辐照剂量达到600 Gy时,幼苗叶中可溶性蛋白含量达到2.31 mg·g-1FW,显著高于CK,是CK的126.92%;对于黄盆栽,当辐照剂量为200和300 Gy时,其幼苗叶片中可溶性蛋白含量与CK 无显著差异,继续增加辐照剂量,叶片中可溶性蛋白含量显著增加,当辐照剂量达到600 Gy时,幼苗叶片中可溶性蛋白含量达到最大值(6.24 mg·g-1FW),显著高于CK,是CK的183.46%。

表1 电子束处理对番茄种子萌发的影响Table1 Effects of electron beam treatment on the seed germination rate of tomato

图1 电子束处理对番茄幼苗叶片中可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effects of electron beam treatment on the soluble protein content in tomato seedlings

番茄种子经电子束处理后,幼苗中可溶性糖含量总体呈升高趋势(图2)。在本试验辐照剂量范围内,随着辐照剂量的增加,黄盆栽幼苗叶片中可溶性糖含量表现出缓慢上升趋势,而1479 幼苗叶片中可溶性糖含量的变化比较复杂。对于1479,当辐照剂量为200 Gy时,幼苗叶片中可溶性糖含量显著低于CK;当辐照剂量为300～500 Gy时,幼苗叶片中可溶性糖含量随着辐照剂量的增加而增加;当辐照剂量达到500 Gy时,可溶性糖含量达到最大值(2.53 mg·g-1FW),为CK的202.4%;而当辐照剂量达到600 Gy时,其可溶性糖含量迅速下降至1.87 mg·g-1FW,为CK的149.6%。

图2 电子束处理对番茄幼苗叶片中可溶性糖含量的影响Fig.2 Effects of electron beam treatment on the soluble sugar content in tomato seedlings

番茄种子经电子束处理后,其幼苗叶片中Pro含量随辐照剂量的增加呈直线上升趋势(图3)。当辐照剂量为600 Gy时,两番茄品种幼苗叶片中Pro含量都达到最大值,其中,1479 幼苗叶片中Pro含量为2.4 μg·g-1FW,为CK的338.03%;黄盆栽中Pro含量为5.32 μg·g-1FW,为CK的217.14%。

图3 电子束处理对番茄幼苗叶片中Pro含量的影响Fig.3 Effects of electron beam treatment on the free proline content in tomato seedling

综上,电子束处理显著影响了番茄幼苗渗透调节物质的含量。两番茄品种幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白和Pro含量总体都随着辐照剂量的增加呈上升趋势,1479 幼苗叶片可溶性蛋白和可溶性糖含量在低剂量(200 Gy)处理时出现显著下降,而后随着辐照剂量增加呈现上升趋势,而黄盆栽无此现象。

2.3 电子束处理对番茄幼苗叶片MDA含量和抗氧化酶活性的影响

由图4可知,两番茄品种种子经过电子束处理后,其幼苗叶片中MDA含量随辐照剂量的增加而增加。对于1479,当辐照剂量为0～300 Gy时,幼苗叶片中MDA含量随着辐照剂量的增加而缓慢增加;当辐照剂量为400～600 Gy时,幼苗叶片中MDA含量随着辐照剂量的增加而快速增加;当辐照剂量达到600 Gy时,其MDA含量达到最大值(6.54 μmol·g-1FW),为CK的416.56%。对于黄盆栽,当辐照剂量为0～500 Gy时,其幼苗叶片中MDA含量一直缓慢增加,当辐照剂量达到600 Gy时,幼苗叶片中MDA含量开始迅速增加,并达到最大值(7.52 μmol·g-1FW),为CK的204.91%。

图4 电子束处理对番茄幼苗叶片中MDA含量的影响Fig.4 Effects of electron beam treatment on the MDA content in tomato seedlings

番茄种子经电子束辐照后,其幼苗叶片中SOD活性也发生了明显的变化,但两品种呈现不同的变化趋势(图5)。当辐照剂量低于300 Gy时,1479 幼苗叶片中SOD活性随着辐照剂量的增加而升高;当辐照剂量为300 Gy时,其SOD活性达到最大值(153.04 U·g-1FW),为CK的138.11%;当辐照剂量高于300 Gy后,幼苗叶片中SOD活性随着辐照剂量的增加而逐渐降低,辐照剂量达到600 Gy时,SOD活性降为113.66 U·g-1FW,为CK的102.57%。黄盆栽种子经电子束辐照后,其幼苗叶片中SOD活性随辐照剂量的增加而升高;当辐照剂量为0～300 Gy时,其SOD活性增加非常缓慢;当辐照剂量为400～600 Gy时,叶片中SOD活性迅速升高,且在辐照剂量为600 Gy时达到最大值(280.31 U·g-1FW),为CK的146.50%。

图5 电子束处理对番茄幼苗叶片中SOD活性的影响Fig.5 Effects of electron beam treatment on the SOD activity in tomato seedlings

两番茄品种种子经电子束辐照后,其幼苗叶片中POD活性总体呈升高趋势,但两品种对电子束的反应不同(图6)。对于1479,当辐照剂量为0～300 Gy时,幼苗叶片的POD活性随着辐照剂量的增加而升高;当辐照剂量为400 Gy时,POD活性下降,与CK 无显著差异;当辐照剂量大于500 Gy时,POD活性又随着辐照剂量的增加急剧上升,且在辐照剂量为600 Gy时达到最大值(77.75 U·g-1FW)。对于黄盆栽,其幼苗叶片中POD活性随着辐照剂量的增加一直缓慢升高,辐照剂量为600 Gy时,POD活性达到最大值(51.98 U·g-1FW),为CK的142.65%。

图6 电子束处理对番茄幼苗叶片中POD活性的影响Fig.6 Effects of electron beam treatment on the POD activity in tomato seedlings

番茄种子经过电子束处理后,其幼苗叶片中CAT活性变化趋势完全不一致,甚至在一定的辐照剂量范围内,两品种的CAT活性呈现相反的变化趋势(图7)。对于1479,当辐照剂量为0～400 Gy时,幼苗叶片中CAT活性随着辐照剂量的增加出现小幅度波动;当辐照剂量为500 Gy时,幼苗叶片CAT活性降至最低值(310.28 U·g-1FW);辐照剂量增加到600 Gy时,CAT活性又急剧上升,达到最高值(376.16 U·g-1FW)。对于黄盆栽,随着辐照剂量的增加,幼苗叶片中CAT活性总体呈降低趋势,但辐照剂量为300 Gy时,幼苗叶片中CAT活性较CK 略有升高;当辐照剂量为600 Gy时,幼苗叶片中CAT活性降至最低值(323.46 U·g-1FW),为CK的91.02%。

图7 电子束处理对番茄幼苗叶片中CAT活性的影响Fig.7 Effects of electron beam treatment on the CAT activity in tomato seedlings

综上,电子束处理显著影响了番茄幼苗MDA含量和抗氧化酶活性。两个番茄品种MDA含量都随辐照剂量的增加呈现一致的上升趋势;随着辐照剂量的增加,1479 幼苗叶片SOD活性呈先上升后下降趋势,POD活性呈先上升再下降而后又上升的趋势;CAT活性总体变化不大;而黄盆栽幼苗叶片SOD和POD活性都随辐照剂量增加呈现上升趋势,CAT活性在低剂量(低于300 Gy)辐照处理时无显著变化,在高剂量(高于300 Gy)辐照处理时呈缓慢下降趋势。

3 讨论

在辐射诱变育种过程中,适宜的辐照剂量是有效诱变的关键。研究表明,低剂量辐射可以促进种子萌发,而过高剂量辐射会抑制种子活力[18-21]。目前关于辐照适宜剂量的研究大多集中在γ射线[18,22-23]等传统的辐射方式,对电子束诱变研究较少,关于电子束适宜辐照剂量的研究更鲜见。本研究利用不同辐照剂量的电子束处理1479和黄盆栽两个番茄品种的干种子,当电子束剂量为600 Gy时(本试验中的最高辐照剂量),番茄种子胚的结构及种子萌发的生理过程产生了一定的变化,种子的发芽率、发芽指数和活力指数都显著降低,但未达到半致死剂量。此外,两番茄品种种子对电子束辐照处理的反应不完全相同,在高剂量电子束处理下,1479种子活力较黄盆栽种子下降幅度大,即1479种子的发芽率、发芽指数和活力指数较黄盆栽种子下降快。由此可见,黄盆栽种子抗电子束辐照能力强于1479种子,这与前人利用γ 辐射处理种子的研究结果[19-21,23]类似。

电子束辐照后,生物体的细胞膜、细胞器及遗传物质等都会受到不同程度的损伤[24-25],但是生物体可以通过渗诱调节在一定程度上减缓伤害。本试验测定了番茄幼苗叶片中可溶性蛋白、可溶性糖及Pro含量,发现随着辐照剂量的增加,幼苗叶片中可溶性糖、可溶性蛋白、Pro含量都呈增加趋势,其中Pro含量增加尤其明显。这与前人研究结果[26-28]类似,但也有不同之处。其原因可能是电子束辐照引起了一些遗传物质的改变,导致相应蛋白的合成发生变化。渗透调节物质对于植株体本身抵抗外来逆境具有重要意义,因而在受到辐照时会发生显著的变化。本研究中Pro含量增加最为明显,很可能是Pro 合成及降解途径相关酶活性发生变化导致了Pro的大量积累。因此,电子束处理不但改变了番茄种子活力,而且显著影响了其幼苗的渗透调节系统。

此外,植株体受到逆境胁迫时会发生膜脂过氧化,导致MDA含量的积累,造成植株体相应细胞器及一些器官的损伤。本研究发现两番茄品种幼苗叶片MDA含量都随着辐照剂量的增加呈现上升趋势,说明电子束辐照处理导致了膜脂过氧化,对细胞膜造成了一定的破坏。这与吴建慧等[26]和李杰等[29]的研究结果较为一致。电离辐射会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),ROS 会诱导生物体内抗氧化酶活性升高,这也在一定程度上减缓了电子束造成的伤害[30-31]。因此,番茄种子受到电子束辐照后,其幼苗体内氧化酶活性也会相应升高[11]。本研究分析了番茄幼苗中SOD、POD和CAT 3种抗氧化酶活性的变化,发现当电子束辐照剂量较低时,1479 幼苗叶片中SOD和POD活性随辐照剂量的增加而升高,而当辐照剂量较高时,这2种氧化酶活性会随辐照剂量的增加而降低或变化无规律;对于黄盆栽,其幼苗叶片中SOD和POD活性一直随着电子束辐照剂量的增加而升高。上述结果表明,黄盆栽抗辐射能力较强,而1479 对辐射更为敏感。但这两个番茄品种中,幼苗叶片中CAT活性均未随辐射剂量的增加而表现出特定的变化趋势,甚至黄盆栽幼苗CAT活性随着辐射剂量的增加而降低。这与前人研究结果[21,27]不完全一致,有待进一步深入研究。

4 结论

本研究用5种不同剂量的电子束辐照处理两个品种的番茄种子,分析电子束处理对番茄种子萌发及幼苗生理生化的影响。结果表明,随着电子束辐照剂量的增加,番茄种子的发芽率逐渐降低,当辐照剂量为600 Gy时,黄盆栽和1479种子发芽率分别为CK的97.2%和77.2%。此外,电子束处理使幼苗渗透调节物质出现大量积累,抗氧化酶活性也发生一定的变化,但不同番茄品种对电子束辐照的抗性存在差异。从种子萌发和幼苗生理生化指标的变化可知,电子束辐照处理对番茄幼苗生长的影响效果显著,不同品种间差异显著。因而,辐照诱变是一个复杂的过程,具有诱变的不确定性和盲目性,需要确定合适的诱变剂量和相应的检测手段。