董翠芳，闫晓燕，李煦，刘树恒，刘长霞

(沧州师范学院 化学与化工学院，河北 沧州 061001)

桑葚是桑树成熟的果实，又名桑果、桑枣、桑乌等，是国家首批纳入药食同源的食材，被誉为“民间圣果”、“百果之先”[1-2]。桑葚中最主要的生物活性成分为花色苷，花色苷是一种天然色素，安全无毒，且具有抗氧化、抗辐射、抗癌、保护心脑血管等功效[3-5]，在保健品、食品、化妆品、医药等领域有着巨大的应用前景。由于桑葚成熟的季节性很强，且无果皮、外表易破损、易变质、不易保存和运输，因此，开发桑葚的深加工技术更有利于桑葚的综合利用，增加产品附加值。

目前花色苷的提取方法主要有：溶剂萃取法、酶法提取、超临界CO2提取、超高压提取、微波辅助提取、超声波辅助提取等[6-10]。其中溶剂萃取法最为传统，具有操作简便、设备简单的优点，但是同时也存在花费时间较长、提取率低的缺点。

超声-微波协同提取法是将微波和超声振动作用方式相结合的一种提取方法[11]，充分利用超声波的空化作用以及微波的热效应，克服了常规的微波提取传热、传质不均，超声波提取产热不足的问题，还实现了在低温条件下的提取操作，避免了高温对天然产物有效成分的破坏。

本试验采用超声-微波协同辅助溶剂萃取桑葚中的花色苷，以花色苷提取率为考察指标，在单因素试验的基础上，通过响应面优化花色苷的提取工艺，通过抗氧化性试验分析其抗氧化能力，旨在为桑葚的综合利用提供一定的理论依据。

1 材料、试剂与仪器

桑葚粉：选用沧州泊头地区的桑葚干，在干燥箱内60 ℃下烘干至恒重后取出晾凉，粉碎过100目筛，保存备用。

无水乙醇、浓盐酸、氯化钾、抗坏血酸(Vc)、无水乙酸钠(均为分析纯)：天津市永大化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，分析纯)：上海国药集团化学试剂有限公司；水杨酸(化学纯)：上海试剂一厂；双氧水(分析纯)：河北省保定化学试剂厂；硫酸铁(分析纯)：天津市大茂化学仪器供应站。

XO-SM200型超声微波组合反应仪 南京先欧仪器制造有限公司；UV-2550型紫外分光光度计 日本岛津公司；722型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；SL-100型高速多功能粉碎机 浙江省永康市松青五金厂；FA2004N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；金怡TDL-5型低速台式大容量离心机 江苏省金坛医疗仪器厂；202-Z型干燥箱 上海试验仪器有限公司；PHSJ-3F型pH计 广州市新英电器有限公司；电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司。

2 试验方法

2.1 桑葚花色苷的提取

称取一定质量桑葚粉，加入适量酸化乙醇(含1% HCl)提取剂混合均匀，超声-微波协同提取，提取液离心定容，利用pH示差法测定花色苷提取率。

2.2 pH示差法测定花色苷提取率

根据文献[12]，采用双波长pH示差法测定花色苷提取率，取两份2 mL花色苷提取液，用两种不同的pH缓冲溶液(pH 1.0的氯化钾-盐酸缓冲液、pH 4.5的醋酸钠-盐酸缓冲液)稀释定容，在黑暗中平衡30 min后取出，测定在510 nm和700 nm处的吸光度，用蒸馏水做参比。

式中：A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5；Mw为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2 g/mol；DF为稀释倍数；V为提取液总体积，mL；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26900 L/(mol·cm)；m为样品质量；L为标准光程，1 cm；γ为花色苷提取率，mg/g。

2.3 单因素试验

通过对花色苷提取的相关文献[13-14]调研发现，大多数试验的最佳条件中，提取温度为40～60 ℃,提取时间为20～40 min，因此本试验固定提取温度50 ℃、提取时间30 min，主要探讨超声波功率、微波功率、提取剂浓度、料液比改变对花色苷提取率的影响。

2.3.1 超声波功率对桑葚花色苷提取率的影响

称取桑葚粉末3.00 g，在酸化乙醇浓度60%、料液比3∶90 (g/mL)、微波功率200 W条件下，改变超声波功率120，240，360，480，600 W进行试验。

2.3.2 微波功率对桑葚花色苷提取率的影响

称取桑葚粉末3.00 g，在酸化乙醇浓度60%、料液比3∶90 (g/mL)、超声波功率360 W条件下，改变微波功率100，150，200，250，300 W进行试验。

2.3.3 乙醇溶液浓度对桑葚花色苷提取率的影响

称取桑葚粉末3.00 g，在料液比3∶90 (g/mL)、微波功率150 W、超声波功率360 W条件下，改变酸化乙醇溶液的浓度50%、60%、70%、80%、90%进行试验。

2.3.4 料液比对桑葚花色苷提取率的影响

固定提取剂90 mL，在酸化乙醇浓度70%、微波功率150 W、超声波功率360 W条件下，改变料液比1∶90、2∶90、3∶90、4∶90、5∶90 (g/mL)进行试验。

2.4 响应面优化试验

在单因素试验基础上设计响应面试验(见表1)，以桑葚花色苷提取率为响应值，采用BBD模型对花色苷提取的最佳条件进行优化。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 The factors and levels of response surface experiment

2.5 花色苷抗氧化性试验

花色苷提取液和相应Vc溶液的浓度梯度分别为质量浓度0.05，0.15，0.25，0.35，0.45 mg/mL，按照文献[15]的操作方法进行花色苷清除羟自由基和DPPH自由基能力的测定试验。

3 结果与分析

3.1 单因素试验

3.1.1 超声波功率对花色苷提取率的影响

图1 超声波功率对花色苷提取率的影响Fig.1 The effect of ultrasonic power on extraction rate of anthocyanins

由图1可知，花色苷提取率随着超声波功率的增加呈现先增大后减小的趋势，在超声波功率为360 W时出现最大值。原因可能是：随着超声波功率的逐渐增大，桑葚渣的细胞壁被超声波的空化作用在短时间内破坏，使花色苷快速溶出，从而导致花色苷的提取率增加。但当超声波功率过大时，桑葚花色苷不稳定，易分解[16]。所以360 W的超声波功率最佳，提取效果最好。

3.1.2 微波功率对花色苷提取率的影响

图2 微波功率对花色苷提取率的影响Fig.2 The effect of microwave power on extraction rate of anthocyanins

由图2可知，微波功率为150 W时，花色苷提取率出现最大值。原因可能是：微波功率小于150 W时，随着微波功率的增大，微波的辐射作用穿透桑葚细胞壁，利于花色苷溶出。微波功率大于150 W，可能会造成花色苷的降解，故出现测定的花色苷提取率下降的情况[17]。所以150 W的微波功率最佳，提取效果最好。

3.1.3 酸化乙醇浓度对花色苷提取率的影响

图3 酸化乙醇浓度对花色苷提取率的影响Fig.3 The effect of acidified ethanol concentration on extraction rate of anthocyanins

由图3可知，在乙醇浓度达到70%时花色苷的提取率最大。原因可能是：浓度过低，提取液的极性较大，有利于糖类或其他水溶性物质溶出，影响了花色苷的溶出，因此提取率较低；反之，提取剂极性过小，水溶性花色苷与提取剂相容性较低，也会影响花色苷的溶出。所以70%的乙醇溶液最佳，提取效果最好。

3.1.4 料液比对花色苷提取率的影响

图4 料液比对花色苷提取率的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on extraction rate of anthocyanins

由图4可知，当料液比为3∶90 (g/mL)时提取率达到最大。原因可能是：在提取液固定为90 mL的情况下，增加桑葚粉的质量，花色苷溶出增多，但当桑葚粉质量超过5 g时，溶液浓度较大，基质受到超声波和微波的影响不均匀，导致细胞破裂不完全，花色苷提取率下降。所以料液比为3∶90 (g/mL)时花色苷的提取效果最佳。

3.2 响应面试验

3.2.1 响应面结果

响应面试验的结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 RSM design and results

续 表

对响应面试验结果进行分析，经过二次回归拟合后，得出花色苷提取率为目标函数的二次回归方程：

Y=13.7-0.24A+0.27B+0.21C-0.56D+0.15AB-0.35AC-0.52AD-0.05BC-0.27BD-0.28CD-1.76A2-2.18B2-2.26C2-2.21D2。

对该方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

由表3可知，失拟项P值为0.0988，不显著，说明该响应面模型存在的误差较小，因此二次模型较合理。此模型的R2为0.9303，呈现极显著性，表明该模型在桑葚花色苷的试验值和拟合值间有较高的拟合度[18]。通过因素显著性来分析模型系数，可以明显得出D、A2、B2、C2、D2均体现出极显著性。

3.2.2 响应面分析

各因素对桑葚花色苷提取率的影响及各因素之间的交互作用见图5。

a.超声波功率、乙醇浓度的交互作用

b.超声波功率、微波功率的交互作用

c.料液比、乙醇浓度的交互作用

d.微波功率、乙醇浓度的交互作用

e.料液比、微波功率的交互作用

f.料液比、超声波功率的交互作用

等高线和响应曲面图直观地反映了4个因素对花色苷提取率的影响。从等高线来看，越接近椭圆，交互作用越显著，从3D曲面图来看，曲面越陡峭交互作用越显著，图5中a，c，e，f 等高线接近椭圆，说明超声波功率和乙醇浓度、料液比和乙醇浓度、料液比和微波功率、料液比和超声波功率的交互作用对桑葚花色苷提取率影响显著；图5中b,d的等高曲线接近圆形，说明超声波功率和微波功率、微波功率和乙醇浓度的交互作用对桑葚花色提取率影响不显著。

3.2.3 响应面的最佳工艺条件

利用响应面分析得出桑葚花色苷的最佳提取工艺：A料液比2.9∶90 (g/mL)，B超声波功率367.6 W，C微波功率152.6 W，D乙醇浓度68.8%，花色苷提取率达到 13.75 mg/g。根据试验仪器的现实情况，调整最佳工艺为：A料液比为3∶90 (g/mL)，B超声波功率360 W，C微波功率150 W，D乙醇浓度70%。在该条件下进行平行试验，提取率分别为13.8，13.6，13.3 mg/g，平均值为13.57 mg/g，与理论值相比较，其相对误差为-1.3%。结果表明，响应面分析得到的最佳条件稳定，重复性好，可行性高。

3.3 花色苷抗氧化性测定

3.3.1 羟自由基清除率的测定

图6 羟自由基清除试验Fig.6 The experimental results of scavenging of hydroxyl radicals

由图6可知，桑葚花色苷的羟自由基清除率随着浓度的增大而上升，当花色苷浓度为0.45 mg/mL时，羟自由基清除率为83.5%，远高于相同浓度Vc的羟自由基清除率54.6%，这与耿然等、张镜等[19-20]的研究结果一致，说明桑葚花色苷具有良好的清除羟自由基效果。

3.3.2 DPPH自由基消除率的测定

图7 DPPH自由基清除试验Fig.7 The experimental results of scavenging of DPPH radicals

由图7可知，随着桑葚花色苷浓度的增加，其清除DPPH能力逐渐增强。当花色苷浓度为0.45 mg/mL时，DPPH自由基清除率为89.3%，远高于相同浓度Vc的DPPH自由基清除率61%，说明桑葚花色苷具有很强的体外清除DPPH自由基的能力。

4 结论

以桑葚为原料，采用超声-微波协同提取桑葚花色苷，在单因素试验基础上，利用响应面法对提取工艺进行优化，结论如下：

响应面优化了花色苷的最佳提取工艺条件：料液比3∶90 (g/mL)、酸化乙醇浓度70%、超声波功率360 W、微波功率150 W，在此参数下花色苷的提取率最大，为(13.57±1.3) mg/g。

抗氧化性试验研究表明，桑葚花色苷对羟自由基和DPPH自由基的清除能力随着花色苷浓度的增加而增大，并且花色苷对两种自由基的清除率远高于同等浓度Vc溶液，说明桑葚花色苷的抗氧化性能优良，有望作为天然抗氧化剂应用于食品、医药、保健品等行业，具有一定的开发前景。