刘丽珍，刘建霞，刘文英，米智*，车锋，田计军

(1.山西大同大学 生命科学学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学 应用生物技术研究所，山西 大同 037009)

黑米是一种黑稻加工产品，为禾本科植物非糯性稻，经长期培育而成[1-2]。与普通白米相比，黑米所含无机盐高1～3倍；蛋白质高46%～66%，其氨基酸组成接近于人体；更含有白米缺乏的特殊成分，如花青素、胡萝卜素、叶绿素和强心甙等[3-4]，因而更具营养和保健功能[5]，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美誉。黑米还具有清除自由基、抑制癌细胞生长、免疫调节、降低动脉硬化、预防心脑血管疾病等多种生理功能[6-7]。《本草纲目》记载：黑米有“滋阴补肾，健身暖胃，明目活血，补肺缓筋”等药效；对头昏目眩、腰膝酸软、夜盲耳鸣症等的疗效尤佳。黄酮类化合物的基本母核是2-苯基色原酮[8]，为植物的重要次生代谢产物，无法自主合成，只能从日常食物中摄取，多存在于水果、蔬菜、谷物、豆类和茶叶中[9-11]，具有高度的化学反应性能，能够清除体内自由基、抗菌消炎、改善血液循环等[12-14]。黑米黄酮化合物可维持血管的渗透压，降低血管脆性，防止血管破裂，消炎止血及提高免疫力等。

目前，黄酮的提取方法有长期浸出法、超声波提取法、酶提取法、水蒸气蒸馏法等，这些方法花费时间长、溶剂用量大、效率不高。本试验采用的索氏提取法具有选择性好、能耗低、设备简单、操作方便等优点。黄酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，但甲醇、丙酮有一定的毒性，乙醇无毒、沸点低，且作为提取剂回收利用方便，可降低成本[15-17]。本研究以黑米为原料，利用索式提取法提取黄酮并通过正交试验优化最佳提取条件，为黑米黄酮在食品、药品研究领域提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米：山西省农业科学院高寒区作物研究所；芦丁标准品(纯度>98%)：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、Al(NO3)3·9H2O、NaNO2、NaOH：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

9070MBE型电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司；XFB-200型小型中药粉粹机 吉首市中诚制药机械厂；JA5003B型精密电子分析天平 上海精科天美科学仪器有限公司；SHSL型电热套 上海树立仪器仪表有限公司；250 mL索氏提取器、UV-1200型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的制作

称取10 mg干燥的芦丁标准品，加无水乙醇摇匀，充分溶解并定容至50 mL，得 0.2 mg/mL 芦丁标准液，置于4 ℃冰箱中保存。同时做空白对照，在510 nm处测其吸光度，重复3次，制作标准曲线，见表1。

表1 芦丁标准曲线的制作Table 1 The making of rutin standard curve

1.3.2 黑米的选择及黄酮提取工艺

选用有光泽、米粒大小均匀、无爆腰、饱满度好、无虫、不含杂质的黑米。将黑米用小型中药粉碎机粉碎后过60目筛，包滤纸分装，收集于干净的塑封袋中。粉末称重→索式提取→提取液定容→测吸光度→计算提取率。

1.3.3 黑米总黄酮的测定方法

准确吸取1 mL的上述待测液，用分光光度计测样品液的吸光度，重复3次，方法同1.3.1，代入回归方程计算出黑米黄酮的提取率。

式中：P表示提取液黄酮质量浓度，mg/mL；N表示稀释倍数；V表示提取液总体积，mL；M表示样品质量，mg。

1.3.4 单因素试验1.3.4.1 乙醇浓度

准确称取黑米粉末(4.000±0.001) g，在液料比为30∶1、回流时间为2 h、提取次数为3次的条件下，设定乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%索式提取黑米总黄酮，测定所提取溶液的吸光度。考察不同乙醇浓度时黄酮的提取率。

1.3.4.2 液料比

准确称取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇浓度为60%、回流时间为2 h、提取次数为3次的条件下，设定液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 (mL/g)索式提取黑米中的总黄酮，测定所得溶液的吸光度。考察不同液料比时黄酮的提取率。

1.3.4.3 提取次数

准确称取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇浓度为60%、回流时间为2 h、液料比为30∶1的条件下，设定提取次数为1，2，3，4，5次提取黑米中的总黄酮，测定所得溶液的吸光度。考察不同提取次数时黄酮的提取率。

1.3.4.4 回流时间

准确称取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇浓度为60%、液料比为30∶1、提取次数为3次的条件下，设定回流时间为0.5，1，1.5，2，2.5 h提取黑米中的总黄酮，测定所得溶液的吸光度。考察不同回流时间时黄酮的提取率。

1.3.5 黑米总黄酮提取工艺的正交试验

在乙醇浓度、液料比、提取次数和回流时间 4个单因素中，分别选取3个影响最大的因素为水平，做 L9(34)正交试验，重复3次，以考察黑米黄酮的最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

由图1可知，标准曲线的横坐标为芦丁标准品浓度(P，m/V)，纵坐标为其吸光度值，得到回归方程：y=12.473x+0.0151，R2=0.9955，呈良好的线性关系。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇浓度对黑米黄酮提取率的影响

图2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

由图2可知，黑米黄酮提取率随着乙醇浓度的不断加大而增加；乙醇浓度在60%时，黄酮的提取率为最大值4.46%；之后乙醇浓度继续加大，黄酮的提取率反而下降。这可能是因为溶剂体积分数的升高增加了乙醇对黑米的渗透性和对细胞膜的破坏性，从而增大了黄酮类化合物的溶解度，提取率也相应增大；在乙醇浓度为60%时，提取率达到最高；当乙醇浓度继续增加会使一些醇溶性色素、脂溶性物质和糖类等杂质溶出，从而降低了黄酮物质的溶解，导致黑米黄酮类物质提取率下降[18]。因此在做正交试验时，分别选取乙醇浓度为 50%、60%、70%做3个水平。

2.2.2 液料比对黑米黄酮提取率的影响

图3 液料比对黄酮提取率的影响Fig.3 The effect of liquid to solid ratio on the extraction rate of flavonoids

由图3可知，黑米黄酮提取率随着液料比的增加而增大；当液料比为30∶1时，黑米黄酮提取率达到最大值，约为4.46%；随着液料比的继续增加，黄酮提取率反而降低。可能是因为液料比过小时，溶剂尚未与样品充分接触；随着液料比的增大，溶剂与样品接触达到最大；之后随着液料比的进一步加大，细胞破裂程度下降，黑米黄酮类物质分子的溶出已达饱和，溶出的其他杂质与黄酮溶出物形成竞争，且被溶解的黄酮发生变性分解，这些导致了黄酮提取率的下降[19]。因此在做正交试验时，选取液料比为20∶1、30∶1、40∶1做3个水平。

2.2.3 提取次数对黑米黄酮提取率的影响

图4 提取次数对黄酮提取率的影响Fig.4 The effect of extraction times on the extraction rate of flavonoids

由图4可知，随着黑米黄酮提取次数的增加,提取率呈上升趋势，当提取次数为4次时，黄酮的提取率达到最大，约为3.47%；超过4次后，黑米黄酮的提取率开始下降。因此做正交试验时，选择提取次数为3，4，5次做3个水平。

2.2.4 回流时间对黑米黄酮提取率的影响

图5 回流时间对黄酮提取率的影响Fig.5 The effect of reflux time on the extraction rate of flavonoids

由图5可知，回流时间在0.5～1.5 h之内，黑米黄酮的提取率呈上升趋势；1.5 h时，黑米黄酮提取率达到最高值，约为5.42%；当回流时间超过1.5 h时，黑米黄酮的提取率开始下降。因此选择回流时间为1，1.5，2 h做正交试验。

2.3 正交试验结果

综合单因素试验结果，以乙醇浓度、液料比、提取次数、回流时间为考察因素，以黄酮提取率为指标，做4因素3水平正交试验，重复3次，结果见表2。

表2 L9(34)正交试验因素水平表Table 2 The factors and levels of L9(34)orthogonal test

表3 正交试验结果与分析Table 3 The results and analysis of orthogonal test

由表3可知，黑米黄酮的最佳组合为A1B2C2D2，由极差值R可知，索式提取黑米黄酮的影响顺序为B>D>A>C。即乙醇浓度为50%，液料比为30∶1，提取次数为4次，回流时间为1.5 h时，黄酮的提取率最大。用优化的组合重复3 次做验证试验，得出的提取率为 5.71%。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

由表4可知，索式提取法提取黑米黄酮的4个因素对黄酮的提取率影响不显著。

3 结论

本试验运用索式提取法提取黑米中的黄酮，根据单因素试验结果和正交试验得出了最佳工艺条件：乙醇浓度为50%，液料比为30∶1，提取次数为4次，回流时间为1.5 h时，该条件下，黄酮提取率最高，达5.71%。影响顺序为B>D>A>C，4个因素对黑米黄酮提取的影响均不显著。验证试验说明该结果可靠，为黑米黄酮的进一步研究提供了理论依据。