辛京京，李和刚，秦怀远，张 宁，赵金山

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）是在生命进化的历程中产生的，它是细菌和病毒长期竞争的产物。病毒以细菌为载体，把自己的基因导入到细菌当中，通过细菌复制达到病毒基因复制的目的；细菌为了消除自身染色体上的病毒基因[1-3]，进化出独特的CRISPR 系统。CRISPR 系统克服了传统基因编辑打靶效率低、实验周期长及应用范围窄等缺点，凭借高效、操作简单等优势在生物学领域获得广泛应用[4-7]，这种简单的RNA 导向基因编辑技术已成为生物学中的革命性工具。

Zetsche 等[8]研究发现了一种使CRISPR 技术更简单、更准确的方法，即CRISPR/Cpf1 系统。Cpf1 是由一条crRNA 引导的v 型Cas 内切核酸酶，它相对于Cas9 具有多方面的优势，包括分子量大小、剪切方式、剪切位置等。Cpf1 拥有广阔前景，但仍有一些亟需解决的技术问题，比如依然存在脱靶效应[9]，因此可以考虑将Cpf1 蛋白改造成Double nickase（双切刻酶），以进一步降低脱靶效应。

Ran 等[10]将Cas9 切刻酶突变体与配对的向导RNA 组合以引入靶向的双链断裂，实验证明使用成对的单链切口可以将细胞系中的脱靶活性降低50～1 000倍。与此类似，Takashi 等[11]研究发现，R1226A（精氨酸突变为丙氨酸）突变体产生切刻酶，切割非靶DNA 链而不是靶链（即只切割单链）。另外，由于野生型Cpf1 识别的PAM 为TTTV，此类识别位点比较稀少，如果简单通过R1226A 的突变来组合双切刻系统，要找到合适的基因编辑靶位点不太容易；针对这一问题，可以考虑在Cpf1 RR 突变体（识别PAM 为TYCV）[12]基础上进行改造，适当拓展双切刻系统的靶标范围。……