郝宇鹏，谢艳，周英杰，柴旭斌，禚汉杰

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙；2.河南省洛阳正骨医院 河南省骨科医院， 河南 洛阳)

0 引言

生长板是一种动态的高度分化的软骨结构，在软骨内骨化和骨的形成中发挥着重要的作用。软骨细胞存在于关节软骨中，具有增殖活性，负责分泌II 型胶原和其它类型的胶原以及非胶原的细胞外基质大分子。成软骨细胞的增殖和分化与脊椎动物骨架的发育有着密切的关系。软骨细胞能分泌和响应一系列的生长因子，包括IGF-1 和IL1。体外培养的软骨细胞是研究软骨修复和关节炎病理的有用模型。

软骨细胞培养一般取材于关节软骨，肋软骨，耻骨联合等部位。利用大鼠生长板软骨细胞进行培养取材容易，但是存在由一个部位取材太少，不容易达到培养所需细胞用量的问题。而且股骨和胫骨是关于生长板相关疾病的重要发病部位，所以本文通过取大鼠股骨和胫骨关节软骨，探索一种简便、可靠的生长板软骨细胞分离培养及鉴定方法，为骨关节疾病体外研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

iCell 原代软骨细胞培养体系( 赛百慷( 上海) 生物技术股份有限公司，货号：Primed-icell-020)；胎牛血清( 美国Gibco 公司，货号：1414426)；0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA，美国Gibco 公司，货号：1734858)；0.1% Ⅱ型胶原酶(Gibco公司，货号17101015)；多聚甲醛( 北京索莱宝科技有限公司，货 号：P1110)；4'，6- 二 脒 基-2- 苯 基 吲 哚(DAPI)( 北 京索莱宝科技有限公司，货号：C0060)；Triton X-100( 北京索莱宝科技有限公司，货号：T8200)；山羊血清( 北京索莱宝科技有限公司，货号：SL038)；兔Ⅱ型胶原一抗( 武汉三鹰生物技术有限公司，货号：15943-1-AP)；Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗(武汉三鹰生物技术有限公司，货号：SA00006-4)；Fluoromount-G 荧光封片剂( 美国SourthernBiotech 公司，货号：0100-01)。

1.1.2 主要仪器

生物安全柜(济南鑫贝西生物技术有限公司，型号：BSC-1500 ⅡA2-X)；CO2细胞培养箱( 上海博迅实业有限公司，型号BC-J160S：)；荧光倒置显微镜(日本Nikon 公司，型号：DS-Ri2)；高速冷冻离心机( 美国Thermo Fisher 公司，型号：Multifuge ×1R)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG-9123A)；电热恒温震荡水槽(上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-2B)；T25 细胞培养瓶(Coming 公司，型号：430639)；血球计数板(德国Marienfeld 公司，型号：Neubauer improved)；24 孔板专用细胞爬片(北京索莱宝科技有限公司，型号：YA0350)；细胞培养孔板(上海卧宏生物科技有限公司，型号WHB-24)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠生长板软骨细胞分离

图1 大鼠股骨、胫骨生长板软骨细胞分离与培养

培养取2 只4 周龄SD 大鼠，断颈法处死，浸入75%乙醇中10 分钟进行消毒。无菌条件下用灭菌消毒后的眼科剪分别取出股骨及胫骨，去除肌肉及骨膜组织，分离生长板软骨。将收集的软骨组织置于超净工作台中，剔除软骨组织上的结缔组织，清除沾染的血液污渍，置于培养基中，然后剪碎成约1mm3大小的碎块，使用无菌磷酸缓冲盐(PBS)清洗数次后加入0.1% Ⅱ型胶原酶与0.25% 胰蛋白酶20mL，置于37℃恒温震荡水槽中震荡消化1.5h，中和，置离心机中1000r/min离心5min，弃上清液，收集组织，再加入0.1% Ⅱ型胶原酶20mL，于4℃过夜消化。取过夜消化的细胞悬液，吹打若干次，然后通过100μm 筛网过滤，收集滤液移入离心管中，置离心机中1000r/min 离心5min，弃上清液，细胞沉淀重悬于软骨细胞培养基中，按5×105个细胞/瓶的密度接种于25cm2的培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度95%培养箱中培养，培养基每3 d 更换1 次。

1.2.2 软骨细胞形态学

观察在倒置相差显微镜下观察培养的软骨细胞的形态变化并拍照记录。

1.2.3 绘制软骨细胞生长曲线

将制备的软骨细胞悬液接种于96 孔板中，作为实验组。空白组以培养基代替细胞悬液，每孔0.2mL，每组设3 个复孔。收集第2 代细胞，调整细胞浓度为每孔5×104个细胞，总共8 块板，置CO2培养箱中37℃培养，隔天换液，连续观察8 天，24h 后开始计数，以后每隔24h 计数一次，每次取1 块板，分别进行计数，计算每3 个复孔的平均值。连续计数8d。每日取一块培养板，每孔加入MTT(5g/L)20uL37℃孵育4h 后弃培养液，加入DMSO 150U/孔，37℃温浴10min。微量震荡器震荡培养板至结晶溶解，将空白对照调零，使用酶标仪490nm波长处测定光密度值(OD)值，以时间作为横轴，光密度值作为纵轴绘制生长曲线。

1.2.4 软骨细胞免疫荧光鉴定[1,2]

于24 孔板中放置3 片无菌盖玻片，每孔加入培养基1mL，取分离获得的生长板软骨细胞，按2×104个/每孔的密度接种。培养过夜后将培养基吸出，PBS 清洗1 遍，加入4%多聚甲醛(PFA)于4℃固定30min，再用PBS 清洗3 次，每次5min。将盖玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，取50uL 破膜封闭液(0.5% Trition X-100 与PBS 1:1 混合，再加10%山羊血清)滴于防水膜上，盖于玻片细胞面上透化2h；然后滴加50uL 兔Ⅱ型胶原一抗工作液(PBS 配置，一抗：PBS=1:100)，4℃孵育过夜，PBS 清洗3 次，每次5min；再滴加Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗工作液(PBS 配置，二抗：PBS=1:500)，室温下避光孵育2h，PBS 清洗3 次，每次5min；最后滴加DAPI(DAPI:PBS=1:1000)染色5min，PBS 清洗3 次，每次5min 后，滴加Fluoromount-G 包埋，荧光显微镜下观察并拍照记录。

2 结果

2.1 软骨细胞形态倒置

相差显微镜下观察，刚接种的软骨细胞为小圆球形，悬浮在培养液中，且细胞的体积大小相似，折光性较强，随着培养，软骨细胞逐渐增大，胞核与核仁也逐渐清晰。培养2 天后细胞开始逐渐贴壁，形态多呈圆形或椭圆形增大，伸长形成伪足(图2，A)。培养4 天后软骨细胞呈扁平状，不规则卵圆形或三角形，有成簇及重叠生长现象出现(图2，B)。培养6 天后软骨细胞90%融合形成单层，细胞形态不规则，呈多边形，星形等，胞体丰富，胞浆均匀，相互密集连接呈“铺路石”状外观(图2，C)。3 代后细胞大多为长梭形，遮光性差。部分细胞由贴壁状态脱落，悬浮于培养液中(图2，D)。

图2 生长板软骨细胞形态变化

2.2 软骨细胞生长曲线

细胞第1-3 天为生长潜伏期，第4-6 天为对数生长期，第6-7 天达到平台期，从第7 天开始出现生长抑制现象。见图3。

2.3 软骨细胞免疫荧光鉴定结果

Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特异性胶原，可利用其免疫荧光对软骨细胞进行鉴定。大鼠生长板软骨细胞经培养72小时后进行免疫荧光实验，结果显示，在荧光倒置相差显微镜下，细胞质被激发出清晰红色荧光(图4B)，细胞核经DAPI染色后在不同波段荧光激发出蓝色荧光(图4，A)，表明分离培养的细胞表达特征性Ⅱ型胶原，符合软骨细胞的生物学特征，证明本实验方法能够分离培养出纯度较高的软骨细胞，可供进一步实验研究使用。

图3 第2 代生长板软骨细胞生长曲线图

图4 生长板软骨细胞免疫荧光鉴定

3 讨论

体外细胞实验对细胞数量和细胞的功能活性要求都很高，但体外传代培养软骨细胞的分裂增殖能力有限，随传代次数的增加会出现去分化及生物学功能活性衰退。因此，以有限的供体活组织收获尽可能多而活性高的原代细胞，降低其体外扩增，在组织工程的研究与临床应用中都非常重要。

生长板软骨由不含纤维血管组织，用酶把基质消化后就可分离出大量高纯度的软骨细胞[1]。分离软骨细胞应用最多的是低质量浓度的胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶顺序染色消化法。胰蛋白酶对软骨细胞外周基质有较强的消化能力，可将大部分的蛋白多糖分解；Ⅱ型胶原酶可将胶原降解成低分子多肽短链物。本实验中先使用胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化除去软骨细胞基质及组织取材时可能带入的杂质细胞，同时疏松软骨颗粒的表面结构，利于胶原酶发挥作用，再使用Ⅱ型胶原酶消化过夜，使基质内的胶原网架解离降解，随后在机械的反复吹打下，便可分离出大量的软骨细胞。

潘思年[4]、陈秋秋[5]等利用关节软骨进行培养，需要多只2-3 周龄的大鼠，所需大鼠数量比较多时增加了实验时间，降低了软骨细胞的存活率。我们用4 周龄SD 大鼠，取股骨和胫骨软骨细胞进行培养，仅需2 只大鼠即可，节约了试验时间和软骨细胞的存活率。

生长板软骨细胞具有软骨细胞的共同特点，即可以合成和分泌包括胶原蛋白及蛋白聚糖在内的多种基质成分。胶原蛋白是关节软骨的主要成分，其中以Ⅱ型胶原蛋白为主，占软骨胶原总量的90%～95%，Ⅱ型胶原表达阳性是软骨细胞的特征性标志[6]，可用于鉴定软骨细胞。Alexa Fluor 染料为罗丹明或香豆素的衍生物，是一种含有活性基团的有机荧光染料，具有激发光谱窄、发射光谱宽、量子产率高、光稳定性好，以及受温度、pH 影响小等优点[7]。与传统的荧光团相比，Alexa Fluor 激发的荧光具有发光亮度更强，灵敏度更高，背景更低，因此更适合于拍照。本实验选用Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔IgG(H+L)作为二抗，经荧光激发后细胞呈现清晰红色，证明了本实验所培养的细胞为软骨细胞。