陈嘉裔

（东南大学成贤学院，江苏南京 210088）

黄连木属（Pistacia）属漆树科（Anacardiaceae）植物，雌雄异株，全世界约10种，分布于地中海沿岸、阿富汗，亚州中部、东部和东南部，菲律宾至中美墨西哥和南美危地马拉［1］。我国有3种，除东北和内蒙古外均有分布［2-3］。本属植物均具有较高的经济用途，如中国黄连木（Pistacia chinensis）作为生物燃料油树种，是一种极其重要的木本能源植物［4］；阿月浑子（Pistacia vera）兼具木本油料和干果两大功能，干果商品名为开心果，是世界四大坚果之一［5］；清香木（Pistacia weinmannifolia）除叶可提取芳香油外，叶及树皮还可作药用［3］。

黄连木属雌雄株的早期性别鉴定在科研与实践方面都具有重大意义。首先，不同性别的植株往往具有不同的经济价值，如中国黄连木雌株因其种子可作为生物柴油的原料而具有相较雄株更高的经济价值，雄株则是不可或缺的授粉树［6-7］，两者种植比例需要合理规划；其次，黄连木童期一般需6～10年，时间漫长，期间若不采取方法对黄连木雌雄株性别进行准确鉴定，将为黄连木育种改良工作带来巨大障碍［8］。因此黄连木性别鉴定研究在其生产以及遗传育种研究方面都显得尤为重要。

近年来，研究发现黄连木属在自然状态下并不仅仅只有雌株、雄株2个性别表现型，如中国黄连木存在雌雄同花序、大西洋黄连木（Pistacia atlantica）不同侧枝性别各不相同等［9-10］，这些现象给黄连木性别鉴定工作带来更多困难。但雌雄个体间的差异总还是会在某些宏观或微观上表现出来，特别是随着近年来分子生物学等新学科新技术的不断发展，更多植物性别鉴定的原理与方法也随之产生，为传统植物的性别鉴定研究工作带来重大变革［11］。

1 黄连木性别鉴定研究进展

1.1 基于形态差异关于雌雄异株植物性别鉴定的研究早期都是从形态学入手，因为雌雄异株植物基因水平不同，植株形态也会存在或多或少的差异，由此可对植株性别进行鉴定。例如，在对植株外部形态的研究中，马丽媛等［13］研究发现，中国黄连木雄株叶片的叶形指数显著小于雌株，雄株的叶形偏狭长，雌株的叶形偏短宽；雄株的叶面积极显著小于雌株；黄连木雌株的主枝分枝角度极显著大于雄株，外观表现为雄株树冠抱拢，雌株树冠开张。谭冬梅等［14］对阿月浑子进行了形态学观测，发现雌雄株的叶形指数也存在极显著差异，结论与中国黄连木研究结果基本一致。而在对植株叶片的微观研究中，王小燕［15］研究发现，10年生中国黄连木雌雄株叶片间气孔密度、气孔长度与宽度并无显著差异，仅在40年生植株中存在极显著性差异，这说明植物形态特征不仅与基因水平上的差异有关，还可能受发育阶段、外界环境等多方面的影响，因此基于外部形态差异的鉴定虽然简单直接，但并非黄连木性别鉴定的可靠依据，只能作为鉴定体系中的一部分。

1.2 基于生理生化差异在生理生化方面，雌雄株的差异主要体现在代谢过程中某些酶的活性差异以及其内源激素、氨基酸、次生代谢物质的含量不同等［16］。杨鹭生等［12］用溴麝香草酚兰（BTB）方法，成功对中国黄连木雌雄株进行性别鉴定。马丽媛等［13］通过测定中国黄连木雌雄株多胺含量以及内源激素的差异来对黄连木进行鉴定，结果表明：中国黄连木雄株叶片在各生长时期Spm（精胺）含量高于雌株、Put（腐胺）含量低于雌株，ABA、IAA含量均大于雌株。然而，Said等［17］通过荧光速率测量，结果表明：乳香黄连木（Pistacia lentiscus）量子产量和色素含量受季节影响，雌雄Fv∕Fm比值在春天显著高于雄株，而夏天雄株高于雌株。王小燕［15］对10年、40年树龄不同生长时期的中国黄连木雌雄株生理指标进行测定，结果显示：2种树龄的中国黄连木雌雄株叶片的可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量，10年生雌雄株间差异达到显著水平，40年生则无明显差异。由此可见，基于生理生化的性别鉴定也并非完全可靠，环境因素以及植物自身发育状况等都会对鉴定结果产生干扰。

1.3 基于同工酶图谱植物的性别主要受基因调控，而同工酶是分子水平的指标，是基因差异在表达水平的体现，具有组织、发育及物种的特异性，是植物性别鉴定的有效途径之一［18］。目前，对同工酶的研究主要有酯酶（EST）、过氧化物酶（POD）以及多酚氧化酶（PPO），其中大多数集中在对雌雄器官中POD的研究。程世平［19］发现中国黄连木雌雄株在过氧化物酶（POD）、酯酶（EST）和多酚氧化酶（PPO）3种同工酶的酶谱上都存在明显差异。李国平等［20］通过对中国黄连木雌雄株发育不同阶段的叶片中PPO和POD相对活性进行比较，发现PPO、POD相对活性在雌雄株间存在显著差异，在老叶中则存在极显著差异。以雌雄个体间存在的显著特征谱带差异来对黄连木进行雌雄鉴别，方法较简单，可用于实验室黄连木的研究，但这一技术依然受限于同工酶组织特异性、发育阶段以及生境等方面的影响，还需进一步完善其可靠性［21］。

1.4 基于特异蛋白差异近年来，蛋白质组学的研究不断深入，这对于雌雄异株植物的性别鉴定工作具有很大帮助［22-24］。Xiong等［25］利用蛋白质组学中的双向电泳技术对中国黄连木雌雄株的叶片和茎段进行研究，共发现10个差异蛋白质点，成功鉴定出其中7个；研究还发现，性别相关的蛋白质具有不同的组织特异性，在枝条中这种差异更为明显：如温度诱导的脂质运载蛋白在雄株枝条的木质部和韧皮部显著表达远高于雌株，而雄株枝条的韧皮部中没有表达磷酸甘油酸激酶蛋白，在雌株却高丰度表达。这些研究结果不仅表明通过蛋白质组学相关技术可有效对黄连木进行性别鉴定，同时也为进一步研究黄连木性别差异的生化机制提供了可能。

1.5 基于分子标记DNA分子间的差异及基因的表达差异是导致植物性别差异的主要原因，目前在黄连木的性别鉴定中，已用到的DNA分子标记技术主要有RAPD、SCAR和SNP。

1.5.1 基于随机引物PCR的RAPD分子标记技术 随机扩增多态性DNA（RAPD）［26，27］是以一寡聚核苷酸序列（4～20bp）为引物，对所研究的基因组DNA进行随机PCR扩增，产生扩增片段长度多态的分子标记技术，具有相对易操作、省时省力、多态性好等特点，受到广泛关注［28］。Hormaza等［29］利用700对RAPD随机引物对阿月浑子进行研究，结果显示引物（opo08945）在945pb处发现雄株有特异带，这一标记的发现对阿月浑子性别鉴定具有重要意义。KAFKAS等［30］对大西洋黄连木472对随机多态引物RAPD，筛选出2对和大西洋黄连木性别相关的标记引物BC156和BC360，其中BC360（500bp）可能与雌性性别决定位点相关。由此可见，RAPD技术的特异引物对黄连木属其他植物的性别鉴定是无效的，且RAPD仍然存在着一些不足：如要经历繁琐的引物筛选过程、对试验条件较敏感、试验重复性差等，目前仅在引物初筛过程中具有一定的应用价值。

1.5.2 基于序列特征化扩增区域的SCAR分子标记技术SCAR分子标记是以PCR为基础，利用RAPD、AFLP等技术找到与目的性状相连锁的标记后发展而来的，在原来10个碱基的引物基础上增加合成上述末端序列约14个碱基构成，具有已知序列、标记共显性、简单易用、重复性好等优点，在植物分子育种中应用广泛［31，32］。Yakubov 等［33］将RAPD转化为SCAR标记来鉴定阿月浑子，发现在909pb和905pb片段，雌雄株分别具有较高的同源性（95%）；基于此片段设计了新的SCAR引物多态位点，在297bp片段处能很好地区分雌雄。Esfandiyari等［34］将DNA 的RAPD 标记基因导入SCAR 区以大规模筛选野生黄连木雌雄种，开发了与黄连木性别相关的1 个300bp 的SCAR 标记（BC1200），该标记只存在于研究的所有雌性个体，而不存在于雄性个体。Sun等［35］也通过ISSR技术找到2个与中国黄连木雌株基因位点相连锁的标记S1和S281，并成功开发出一个为636pb的SCAR标记（FS281）片段。程世平［19］通过对200条RAPD随机引物的筛选，筛选出可在雌雄株基因池间扩增出差异条带的6条引物，并成功开发了与雌株相关的550bp的SCAR引物S1420-11C，可对中国黄连木的性别进行准确鉴定。这些研究结果表明SCAR标记对黄连木属的植株标记并不通用，Kafkas等［36］对大量阿月浑子和野生黄连木种质资源进行测试，结果也表明有遗漏的雌株和误报的雄株个体。

1.5.3 基于DNA芯片技术的SNP分子标记技术 单核苷酸多态性（SNP）是指同一位点的不同等位基因之间只有1个核苷酸的差异或只有小的插入、缺失。SNP是一种多态性较高的双等位型标记，是一种应用前景广阔的遗传标记物［37］。Kafkas等［36］以阿月浑子9个雌株和9个雄株为材料，利用Hi-Seq2000进行测序（Illumina），通过RAD开发出33757个SNP标记，确定了38对候选连锁标记，通过检测并设计SNP引物，其中8对能准确区分阿月浑子性别后代，并在大量黄连木属植物中得以验证。SNP技术具有基因定位功能，能准确区分显性和共显性基因位点，使得追溯基因源成为可能。同时，基于SNP 的高度多态性也为黄连木属其他植株的鉴定提供一种新的手段。

2 结语

综上所述，基于外部形态、生理生化的2种方法相对简单易行，都为黄连木性别鉴定研究提供了事实依据，但不够准确，容易受环境影响，利用价值不高；利用同工酶、特异蛋白、分子标记等技术的鉴别结果虽然相对可靠，但这些鉴定技术所需仪器和环境要求普遍较高，同时存在操作繁琐、鉴定价格昂贵等问题，在实际生产中也难以推广运用。植物性别决定机制主要由遗传因子和环境因素决定，随着分子生物学技术的日益发展，综合利用各种性别鉴定技术，逐步了解控制黄连木性别遗传的机理，黄连木早期性别鉴定难题将会得到解决。