张爱琼，贺志昊（编译）

（毕节市动物疫病预防控制中心，贵州 毕节 551700）

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，对全球养猪业造成严重威胁，给中国以及东南亚在内的一些国家造成了严重的经济损失。急性型ASF感染的猪只在感染后的临床表现为昏睡、厌食、高烧和死亡；在慢性型ASF中，猪只临床症状要轻得多。由于现今没有有效的非洲猪瘟疫苗对猪只进行免疫来避免该病毒的感染，疫病的防控严重依赖于生物安全与对被感染猪的早期诊断检测，因此诊断工具对于该病早期发现和实施控制措施至关重要。

Petrovan V等人基于非洲猪瘟病毒p72和p30抗原应用于酶联免疫吸附试验作为非洲猪瘟血清学检测的重要工具，对与其他免疫原性蛋白一样p54结构蛋白进行研究。除p72和p30抗原外，非洲猪瘟的另一个血清学目标是有183个氨基酸的结构蛋白p54，p54是进行ASFV检测和监测的良好血清学靶标，它是病毒基因E183L的产物，位于内包膜病毒体中。p54是一种第二型病毒膜蛋白，其内部N-末端60个氨基酸，随后是一个跨膜结构域和一个131个氨基酸的C-末端结构域，据预测其外域具有几个糖基化和磷酰化位点。该蛋白质具有保守和可变的肽区，p54蛋白间的差异很大程度上由位于蛋白C端一半的Pro-Ala-Ala-Ala重复序列的数量决定，基因变异与毒力无关，但有助于将病毒分为不同的基因型。p54与p30共同参与病毒颗粒与靶细胞的结合，在病毒内化后，p54与宿主蛋白dynein相互作用，导致病毒粒转运到细胞的核周区域，p54中相应的动力蛋白结合结构域（DBD）也参与Caspase-3的激活和凋亡的诱导，位于氨基酸149-161之间的DBD，是ASFV感染猪的对照血清中和目标。抗p54抗体最早在感染后8 d出现，并持续数周。Gallardo等人描述的基于p54酶联免疫吸附试验的血清学试验显示，与世界动物卫生组织的酶联免疫吸附试验相比，敏感性为98 %，特异性为97 %。此外，在37 ℃储存1个月后，ASFV抗体阳性样品的p54反应性仍为阳性。因此，p54连同p30和p72是代表了检测ASFV抗体的一组理想的抗原靶标。抗体检测的改进包括并入抗原特异性mAb转化为封闭ELISA（bELISA）测试，商业上可用的bELISA测试Ingenasa-Ingezim PPA Compac K3，是基于对p72抗体的检测。

Petrovan V等人对ASFV表位结构蛋白p54进行研究，首先进行动物实验获取血清，同时采用基因工程技术以非洲猪瘟 Georgia2007/1株（GenBank登 录 号：FR682468）为模板，用特异性引物F:5´-TTGGCCAACTTGATAGC-3´和R:5´-ATACGTGCGTCGATGGAGA T-3´扩增包含60-178氨基酸的p54基因的核苷酸序列（没有预测的跨膜区域），并将其克隆到pFastBac/HBMTOPO载体（InvitrogenBac-to-BacHBMTO P）中，转化到杆状病毒穿梭载体（bacmid）中。运用重组杆菌DNA转染SF9和Hi-Five昆虫细胞，用附着在C端的6×His标签表达p54融合蛋白。该蛋白在杆状病毒感染的细胞中表达，并用HisPurTM Cobalt色谱Cartridge（Thermo Fisher）纯化，然后进行小鼠的免疫和单克隆抗体（mAbs）的制备。同时，其以ASFV BA71 V株（GenBank登录号U18466）的p54基因序列用于制备密码子优化的p54多肽片段（集成技术）。为5个多肽片段制备了合成的DNA片段；p54（54-113）、p54（83-143）、p54（113-183）、p54（1-183） 和p54（54-183），在每个DNA片段的5´和3´末端插入SacII和EcoRI限制性酶切位点，并被克隆到表达5xHis泛素融合蛋白的细菌表达载体中，将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并进行多肽的表达和纯化。在纯化后进行酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒中和试验。

其结果显示，除p54（1-183）外，所有重组蛋白都在大肠杆菌中表达，为5xHis-泛素融合蛋白（添加5xHis-泛素标签是为了亲和纯化和提高大肠杆菌中的蛋白表达）。全长蛋白p54（1-183）在没有泛素的情况下表达。多肽片段p54（54-113）、p54（83-143）和p54（113-183）在天然条件下使用试剂盒中提供的缓冲液进行亲和纯化，在天然缓冲液纯化条件下不溶的p54（1-183）蛋白在8 M尿素存在下纯化。p54（54-183）多肽也是不溶的，但在较温和的条件下用CAPS/Sarkosyl缓冲液纯化，用5xHis单克隆抗体免疫印迹的SDS PAGE显示所有p54多肽构建体如预期迁移。

最初针对杆状病毒表达的Georgia p54（60-178）多肽筛选了单克隆抗体，用于免疫小鼠。免疫荧光试验（IFA）在固定的ASFV Lisbon/60感染的Vero细胞上筛选12种阳性单克隆抗体，结果确定了7个IFA阳性克隆。由于肽序列的相似性，来自Lisbon/60和BAV71 V的p54多肽可以用作Georgia的替代物。5个IFA阴性克隆没有进行进一步的研究。通过白细胞和酶联免疫吸附试验筛选出7种IFA阳性单克隆抗体，在抗大肠杆菌中表达的BA71 V p54（1-183）。5个单克隆抗体，对感染了Lisbon/60的Vero细胞进行IFA染色。在涂有大肠杆菌表达的p54（54-183）的平板上进行酶联免疫吸附试验，用大肠杆菌表达的p54（1-183）进行蛋白质印迹，重组蛋白基于ASFV BA71 V。对于酶联免疫吸附试验，吸光度值大于阴性对照的3个标准偏差被认为是阳性结果。对典型ASFV分离株p54抗原区的比较，发现26种病毒的p54寡肽序列，重新呈现了24种已知ASFV基因型中的20种。当所有5种单克隆抗体在中和试验中结合时，中和活性存在于所有测试的稀释液中。

患ASF的病猪血清对p54多肽和寡肽的识别是用ASFV分离物OURT88/3实验性感染的16头猪的血清对照p54多肽进行测试。OURT88/3是一种毒性相对较低的分离株，可诱导强有力的抗体反应，结果显示了多肽p54（54-183）和p54（83-143）的平均吸收率最高，同时血清也与寡肽组反应。

总之，在缺乏有效疫苗的情况下，对ASF的控制依赖于准确、高效和低成本的检测方法。与p72、p30与pp62一样，p54属于一组结构蛋白，具有免疫原性，通常参与疫苗研制和血清学检测。在其研究中，mAb和感染猪识别的p54中线性抗原结构域的特征提供了有关使用p54作为血清学抗原的信息。以前对抗原区域的研究仅限于位于DBD氨基酸149-161之间的单个线性表位。但是，其研究中产生的单克隆抗体均未识别出DBD区域或未显示出明显的病毒中和活性。即使DBD肽序列具有抗原性，当用全蛋白免疫小鼠时它可能也没有足够的免疫原性。杆状病毒系统的一个优势是产生具有翻译后修饰（例如糖基化）的蛋白质。即使用于免疫小鼠的p54（60-178）多肽不具有N-糖基化位点（NXS/T），但据预测它仍具有多个O-糖基化位点，翻译后修饰对mAbs识别p54的作用尚不清楚。在最初的表位研究中使用了大肠杆菌表达系统，是基于该系统先前已用于生产p54来进行诊断分析。其研究评估了5个mAb用作检测ASFV感染的试剂（用于抗体或抗原检测）的能力。开发用于检测p54抗体或用于病毒检测酶联免疫吸附试验中p54抗原捕获试验的b-ELISA的第一步是制备和鉴定识别保守表位的单克隆抗体，产生了一组针对杆状病毒表达的p54重组蛋白的单克隆抗体。表位定位显示，来自ASFV感染猪的单克隆抗体和血清识别p54内的保守和可变区域，ASF病猪的血清也能识别表位。这些数据为开发新的血清学检测方法创造了机会，这些方法可以改善ASF诊断。其研究中描述的5种抗p54mAbs在p54中识别了几个保守和可变的区域，共同确定了位于p54上的重要抗原和免疫原性区域，部分mAbs识别的表位也被AS FV感染猪的血清识别。与其他血清学检测一起，为改进ASFV诊断提供了新的工具，将有助于改进对ASFV感染的检测。