谭安安，陈晨

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病，CHD）与内源性物质的代谢异常密切相关，炎症和氧化应激反应亡引起的动脉粥样硬化（AS）是导致冠心病发生、发展的重要原因[1,2]。PI3K/AKT通路不仅具有调控细胞增殖、凋亡和行为的功能，也是重要的调控氧化应激反应和反应的通路，PI3K/AKT通路激活通过直接诱导其下游的血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，消除活性氧（ROS）水平并抑制炎性细胞因子白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）等炎性因子的表达，缓解氧化应激反应[3,4]。研究显示提高CHD动物模型中的PI3K/AKT通路的水平可抑制氧化应激反应和炎性反应，保护心肌细胞。长春西汀是一种磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，不但可调控AS的发生，还可调节生物电信号放松平滑肌细胞增加血流量[5]。最新研究显示长春西汀可缓解CHD并抑制炎性反应[6]。但关于长春西汀缓解CHD的机制仍不明确。本文主要通过研究长春西汀对CHD大鼠模型氧化应激反应和PI3K/AKT的影响，探究分子机制，为临床应用长春西汀治疗CHD，提供更好的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 SD大鼠（SPF级，雄性220～250 g，上海斯莱克实验动物中心，中国）。长春西汀（H20133334，遂成药业，中国）。SMT100V小动物自动生化分析仪（南京电子医疗器械厂，中国）。Hoechst 33258溶液试剂（Merck 公司，德国）。CCK-8和ELISA试剂盒（碧云天公司，中国）。酶标仪（Model 680，Bio-Rad，美国）。组织匀浆机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。TRIzol（Sigma公司，美国）。PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq试剂盒（Takara公司，日本）。RIPA裂解缓冲液（中国，北京，Beyotime）。BCA试剂盒（武汉博斯特生物技术有限公司，中国）。抗体购自美国Abcam公司。PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）。DMEM培养基和抗体、血清（Invitrogen公司，美国）。显微镜和倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2 分组和建模 30只SD大鼠分为对照组、CHD组和CHD+长春西汀组（每组n=10），根据文献构建CHD模型[7]，自制高脂饲料持续喂养8周，高脂饲料在正常饲料中加入蛋黄粉（10%）、胆固醇（2%）、猪油（10%）、丙基硫氧嘧啶（0.2%）、胆酸钠（0.5%），30 g/d。对照组的10只大鼠应用正常饲料喂养，30 g/d。通过尾静脉收集血样，用SMT100V小动物自动生化分析仪检测三酰甘油（TG）和胆固醇（TC）和高密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）验证建模结果。CHD+长春西汀组大鼠腹腔注射长春西汀，剂量为1.0 mg/kg[8]，其余两组大鼠注射等量的生理盐水作为对照，连续7 d。

1.3 指标和方法

1.3.1 ELISA 应用ELISA检测心肌酶指标、炎性因子和内皮功能指标。大鼠麻醉后处死，采集心脏内的血液样本，离心（2000 rpm，20 min）后收集上层血清。根据试剂盒说明书分别加入抗体和显色剂，通过酶标仪检测450 nm处吸光度，根据标准曲线计算乳酸脱氢酶（LD）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）的浓度，炎性因子IL-6和TNF-α的浓度，以及内皮功能指标内皮素-1（ET-1）和一氧化氮（NO）。

1.3.2 HE染色检测心肌细胞损伤 大鼠腹腔注射戊巴比妥后断头处死，取出心脏，收集结扎周围的心肌组织用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脱水，包埋在石蜡中，制成厚度为4 μm的切片制作玻片标本。加入Mayer's苏木精在室温下赋孵育10 min，加入0.5%曙红溶液室温下孵育3 min，显微镜下观察。

1.3.3 氧化应激指标 将心肌组织制作成组织匀浆，以3000 rpm离心25 min，根据的速度氧化应激试剂盒（三工生物技术有限公司，中国）检测丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水品。

1.3.4 qPCR 使用Trizol获得心肌组织中总RNA，使用逆转录cDNA试剂盒逆转录1μg RNA用于合成cDNA（42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃保存）。使用SYBR Green PCR Master Mix和PCR检测系统进行qPCR实验（95℃/10 min，40个循环，94℃/15 s，60℃/1 min， 60℃/1 min，4℃保存）。使用GAPDH6作为内参，比较循环阈值（ΔΔCt）用于分析PI3K和AKT mRNA的水平表达。

1.3.5 Western blot 将心肌组织用匀浆机均匀研磨萃取总蛋白，通过BCA试剂盒测量浓度。

分别取总量为40 μg的总蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（PAGE）（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定电压下与PVDF膜进行湿转移。在5%牛血清白蛋白（BSA）中于室温孵育1 h。将1:500稀释的anti-PI3K和anti-AKT添加到分离的蛋白质中，4℃下孵育过夜。洗涤后在室温下添加二抗孵育1 h。加化学发光试剂显影。GAPDH用作内部参考。Image J软件分析目标条带灰度值。

1.4 统计学处理 统计分析使用SPSS 19.0软件。数据以平均值±标准偏差（SD）表示。多组间比较行单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。P＜0.05，为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 长春西汀对CHD模型大鼠血脂的影响 CHD组大鼠的TC（3.25±0.35）mmol/L、TG（1.36±0.14）mmol/L、LDL（1.89±0.27）mmol/L均高于对照组（P＜0.05），CHD+长春西汀组的TC（2.64±0.31）mmol/L、TG（0.93±0.12）mmol/L、LDL（1.25±0.22）mmol/L水平高于对照组而低于CHD组（P＜0.05），表1。

表1 长春西汀对CHD模型大鼠血脂的影响

2.2 长春西汀对CHD大鼠模型心肌酶指标的影响 CHD组大鼠的LD（2374.27±278.43 IU/L）与CK-MB（1264.44±142.53 IU/L）均高于对照组（P＜0.05），CHD+长春西汀组LD（1804.93±271.36IU/L）和CK-MB（865.28±131.69IU/L）高于对照组而低于CHD组（P＜0.05），表2。

表2 长春西汀对CHD大鼠模型心肌酶的影响

2.3 长春西汀对CHD大鼠模型炎性因子的影响 CHD组大鼠的IL-6（14.47±2.89）pg/ml和TNF-α（11.46±2.04）pg/ml均高于对照组（P＜0.05），CHD+长春西汀组的IL-6（9.80±2.45）pg/ml和TNF-α（7.52±2.01）pg/ml水平高于对照组而低于CHD组（P＜0.05），表3。

表3 长春西汀对CHD大鼠模型炎性因子的影响

2.4 长春西汀对CHD大鼠模型内皮功能的影响CHD组大鼠的ET-1（1.92±0.18 pg/ml）高于0.18 pg/ml）高于对照组而NO（30.75±6.73）μmol/L低于对照组（P＜0.05）。CHD+长春西汀组的ET-1（1.59±0.16）pg/ml高于对照组低于CHD组，而NO（39.24±9.76）μmol/L低于对照组，而高于CHD组（P＜0.05），表4。

表4 长春西汀对CHD大鼠模型内皮功能的影响

2.5 长春西汀对CHD大鼠心肌组织损伤的影响对照组大鼠的心肌细胞成纤维状有序排列，细胞质和细胞核染色均匀，细胞核饱满；CHD组大鼠心肌细胞染色不均匀，排列紊乱；CHD+长春西汀组的心肌组织损伤情况较CHD组有所缓解，心肌细胞染色不均匀但排列有序。

2.6 长春西汀对CHD大鼠氧化应激指标的影响CHD组大鼠的MDA（10.56±1.06）nmol/ml高于对照组，SOD（116.84±10.64）U/ml低于对照组（P＜0.05）。CHD+长春西汀组的MDA（5.93±0.55）nmol/ml显著高于对照组而低于CHD组，而SOD（158.59±12.18）U/ml低于对照组而高于CHD组（P＜0.05）。

2.7 长春西汀对CHD大鼠PI3K和AKT mRNA的影响 PI3K和AKT mRNA水平（1.32±0.13，1.05±0.11）显著低于对照组（P＜0.05），CHD+长春西汀组的PI3K和AKT mRNA水平（4.75±0.46，4.83±0.47）显著高于对照组和CHD组（P＜0.05）。

2.8 长春西汀对CHD大鼠PI3K/AKT通路的影响PI3K和AKT蛋白水平（0.98±0.08，1.05±0.09）均显著低于对照组（P＜0.05），CHD+长春西汀组的PI3K和AKT蛋白水平（3.42±0.32，3.36±0.31）高于对照组和CHD组（P＜0.05），图1。

图1 Western blot检测长春西汀对CHD大鼠PI3K和AKT蛋白的影响

3 讨论

心血管疾病是全球死亡的主要原因[9]。AS引起的CHD以及相关的疾病是心血管疾病的最主要因素，包括血管腔狭窄、闭塞、心肌缺血、缺氧、坏死，心肌细胞的凋亡等[10]。

长春西汀是从毛竹毛叶中分离的一种半合成生物碱衍生物，通过抑制Na+通道和清除羟自由基来缓解氧化应激反应和细胞代谢[11-14]。AS不但是CHD的关键发病诱因，也是中风等脑血管疾病的主要机制之一，国内研究显示长春西汀对脑供血不足合并CHD病情起到缓解作用[15]。本次研究结果显示长春西汀可明显降低血脂指标，还可抑制炎性反应，从而提高血管内皮功能，保护心肌细胞。提示长春西汀可能通过清除ROS、抑制炎性反应保护血管内皮细胞，提高冠脉供血，缓解心肌细胞损伤，起到治疗CHD的作用。

氧化应激起因于ROS的产生与抗氧化剂机制清除之间的不平衡，机体具有抗氧化防御机制，该机制由抗氧化剂分子（如谷胱甘肽）和酶（如SOD等）组成，以应对氧化应激。在生物分子中，脂质易受到氧化应激,多不饱和脂肪酸和LDL等脂质是主要目标，AS也是引起ROS的病理基础之一[16]。氧化应激水平受到PI3K/AKT通路的调控，PI3K/AKT会通过调控NF-κB或Wnt等途径提高SOD的表达抑制氧化应激反应[17]。本研究结果显示长春西汀可在mRNA和蛋白的水平上显著抑制CHD大鼠心肌组织中PI3K/AKT通路，并抑制MDA和促进SOD的表达。研究显示长春西汀通过抑制NF-κB通路和诱导Nrf2/ARE通路抑制氧化应激反应[18]。在脑缺血/再灌注动物中，长春西汀对PI3K/AKT起到诱导作用，并抑制炎性反应保护神经损伤[19]。提示在CHD大鼠模型中，长春西汀通过诱导PI3K/AKT的表达抑制机体的氧化应激反应，不仅能保护冠脉内皮细胞功能提高心肌血供，还能抑制炎性反应，缓解心肌细胞损伤。

综上所述，长春西汀可能通过促进PI3K/AKT通路抑制氧化应激反应和炎性反应，从而保护血管内皮功能和缓解心肌组织损伤，对CHD大鼠模型起缓解作用。但关于长春西汀调控PI3K/AKT通路的分子机制需进一步分析，疗效仍需临床研究验证。