魏蔚，孙晓婷，孔维颖，李海燕，王显

动脉粥样硬化（AS）是心血管系统疾病中最为常见的疾病，基本病理改变包括动脉内膜的脂质沉积，内膜灶状纤维化，粥样斑块形成[1]，冠状动脉（冠脉）斑块破裂可引发心肌梗死，严重危害公众健康。树突状细胞（DCs）是体内已知功能最强大的专职抗原呈递细胞，病理结果显示粥样硬化斑块中有大量DCs，DCs参与斑块破裂的过程[2]。络风宁1号方为东直门医院王显教授根据络风内动理论创制的治疗冠心病的方剂，由徐长卿、三七、地龙、黄芪、冰片组成，临床对改善不稳定心绞痛有确切疗效[3,4]。前期研究表明，络风宁1号方对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）介导的树突状细胞的成熟有抑制作用[5]。本研究经过分析络风宁1号方对ox-LDL介导的树突状细胞的成熟过程中白介素27/Janus激酶信号转导子和转录激活子（IL-27/JAK-STATs）信号通路的影响，旨在探究络风宁1号方影响ox-LDL介导的树突状细胞成熟的机制，为动脉粥样硬化的诊疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 主要药品及试剂 络风宁1号方：徐长卿、地龙、黄芪、三七和冰片，以上中药由北京中医药大学东直门医院中药房提供。人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋，LTS1077），人CD14免疫磁珠（Miltenyi，130-050-201），胎牛血清（G i b c o，1 0 1 0 0-1 4 7），重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G MCSF，Peprotech，300-03），重组人白介素4（IL-4，Peprotech，200-04），ox-LDL（广州奕元，YB-002），人IL-27 DuoSet ELISA试剂盒（R&D，DY2526-05），ELISA辅助试剂盒（R&D，DY008），白细胞分化抗原36（CD36）抗体（abcam，ab133625），凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）抗体（abcam，ab124427），Janus激酶1（JAK1）抗体（abcam，ab133666），Janus激酶2（JAK2）抗体（abcam，ab108596），信号转导子和转录激活子1（STAT1）抗体（abcam，ab109320），信号转导子和转录激活子3（STAT3）抗体（abcam，ab68153），β-actin抗体（CST，4790S），二抗（abcam，ab6721）。

1.2 人树突状细胞的诱导分化 选取10例经冠脉造影确诊，造影结果显示至少1支或以上冠脉狭窄（直径）≥50%的冠心病患者（经过北京中医药大学东直门医院伦理委员会批准，项目编号DZMEC-KY-2020-64），在接受静脉药物治疗前空腹抽血5 ml。将血样用PBS按照1:1比例稀释，再缓慢加在等量人外周血淋巴细胞分离液上层，2500 rpm离心30 min后，液体分为4层，吸取第2层环状乳白色淋巴细胞层，洗涤后即得到外周血单个核细胞（PBMCs）。将收集的PBMCs计数，加入人CD14免疫磁珠，低温孵育15 min后洗涤细胞，将细胞悬液通过磁力架上的细胞分选柱，得到CD14+的PBMCs。将纯化后的PBMCs在完全培养基中培养，完全培养基成分为：基础培养基RPMI 1640，10%胎牛血清，100 ng/ml GM-CSF，50 ng/ml IL-4，培养条件为37.0 ℃，5% CO2。隔日半量换液，培养至第6 d，分化为未成熟的DCs。

1.3 络风宁1号方大鼠含药血清的制备 络风宁1号方成人常用剂量为徐长卿12 g、地龙10 g、黄芪10 g、三七3 g和冰片0.1 g，其中三七和冰片冲服。将10只大鼠随机分为2组：药物组和空白组，每组各5只。大鼠每千克体重灌药剂量为人的14倍，每100 g大鼠每日灌药剂量为：徐长卿 0.56 g，地龙0.48 g，黄芪0.48 g，三七0.14 g，冰片0.0048 g，（以生药计）。各组大鼠每天称重后灌胃，早晚各一次，空白组以等量的生理盐水灌胃。连续灌胃7 d后腹主动脉取血，离心后取上层血清，同组血清混合，灭活分装后保存在-80 ℃冰箱。

1.4 细胞干预过程 将培养到第6 d的未成熟DCs，均匀种于六孔板中，分为3组：①空白组：未成熟DCs+空白大鼠血清；②模型组：未成熟DCs+空白大鼠血清+ox-LDL；③药物组：未成熟DCs+络风宁1号方大鼠含药血清+ox-LDL。ox-LDL浓度为100 μg/ml，基础培养基为RPMI 1640，各组血清含量为10%，培养48 h后进行检测。另准备3组和上述分组对应的不含细胞的培养基，同样条件下培养48 h。

1.5 酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞上清中IL-27的水平 向酶标板每孔中加入100 μl包被液以包被抗体，密封后室温孵育过夜。向每孔中加入300 μl封闭液，密封后室温孵育1 h。收集各组细胞上清液，上清液加入到酶标板样品孔内，标准品稀释后加入至标准品孔内，每孔100 μl，密封后室温孵育2 h。洗板后每孔加入100 μl检测液，密封后室温孵育2 h。洗板，每孔加入100 μl酶结合物工作液，密封后避光室温反应20 min。洗板，每孔加入100 μl 显色液，避光室温反应20 min。每孔加入50 μl 终止液，充分混匀。用酶标仪450 nm检测各孔吸光度。

1.6 Western blot法检测CD36、LOX-1、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3蛋白水平 收集细胞，用PBS多次洗涤后加入含蛋白磷酸酶抑制剂的裂解液，超声破碎，冰上放置10 min，低温高速离心后提取总蛋白，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min，分装冻存。在聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中使蛋白充分电泳，再转移至聚偏二氟乙烯膜（PDVF）上，蛋白封闭1 h，添加一抗，4 ℃孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶（HRP）结合的二抗，室温下孵育1 h。洗涤后用化学发光试剂显影，使用ImageJ软件分析蛋白相对表达水平。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。所有计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，组间比较行单因素方差分析，两两对比采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置相差显微镜观察细胞形态 细胞培养至第6 d，倒置相差显微镜下观察，细胞体积明显增大，悬浮在培养基中，细胞表面可见不规则状毛刺凸起（图1）。

图1 细胞悬浮，表面可见不规则毛刺，分化为未成熟的DCs（400×）

2.2 ELISA法检测细胞上清中IL-27的水平 IL-27为外分泌型，存在于细胞上清液中，用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组细胞上清中IL-27水平时，考虑到可能会受到不同培养基影响，故在同样的条件下检测了不含细胞的各组培养基中IL-27的含量，计算差值为校正后的IL-27浓度，最终结果见表1。校正后模型组细胞上清中的IL-27浓度比空白组升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；药物组细胞上清中的IL-27浓度比模型组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 Western blot法检测CD36、LOX-1、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3蛋白水平 蛋白质印迹法（Western blot）检测结果见图2，蛋白条带灰度值Z分析结果见表2。实验结果显示，模型组中CD36、LOX-1、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3的蛋白表达均较空白组增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），药物组中上述各蛋白的表达较模型组减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。蛋白条带的灰度值Z=目的蛋白灰度值/相应内参条带灰度值。

表1 ELISA法检测各组细胞上清中IL-27的浓度[（±s），n=6]

表1 ELISA法检测各组细胞上清中IL-27的浓度[（±s），n=6]

注：与空白对照组相比有统计学差异，aP＜0.05；与模型组相比有统计学差异，bP＜0.05

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图2 Western Blot检测各组中CD36、LOX-1、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3蛋白水平（空白组：未成熟DCs+10%空白大鼠血清；模型组：未成熟DCs+10%空白大鼠血清+ox-LDL；药物组：未成熟DCs+10%络风宁1号方大鼠含药血清+ox-LDL。ox-LDL浓度为100 μg/ml，培养48 h。CD36：白细胞分化抗原36；LOX-1：凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1；JAK1：Janus激酶1；JAK2：Janus激酶2；STAT1：信号转导子和转录激活子1；STAT3：信号转导子和转录激活子3）

表2 Western Blot检测各组中CD36、LOX-1、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3蛋白水平灰度值Z[（±s），n=3]

表2 Western Blot检测各组中CD36、LOX-1、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3蛋白水平灰度值Z[（±s），n=3]

注：与空白对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；CD36：白细胞分化抗原36；LOX-1：凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1；JAK1：Janus激酶1；JAK2：Janus激酶2；STAT1：信号转导子和转录激活子1；STAT3：信号转导子和转录激活子3

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3 讨论

本实验结果表明，在ox-LDL促进人外周血来源的DCs的免疫成熟过程中，IL-27/JAKSTATs信号通路相关蛋白IL-27、JAK1、JAK2、STAT1、STAT3的表达升高，ox-LDL相关受体LOX-1和CD36的表达水平也相应升高。而络风宁1号方则可以抑制该信号通路相关蛋白及ox-LDL受体的表达。因此，我们认为络风宁1号方可以通过对IL-27/JAK-STATs信号通路的抑制，抑制ox-LDL介导的DCs免疫成熟。

人外周血中DCs含量较少，难以作为实验材料，一般常用外周血来源的单核细胞，经GMCSF和IL-4诱导分化来获得大量DCs。传统分离方法是根据PBMCs中不同细胞的贴壁时间差，将单核细胞从PBMCs中分离出来，此种方法细胞在贴壁过程中易受残存血小板的影响，多次洗涤虽然可以减少血小板的数量，但细胞得率也会受影响，且诱导出的DCs细胞纯度不高，分离过程耗时较长。优点是较为经济，因此应用广泛。CD14+磁珠分选不受外周血中其他成分的影响，可以快速分选出高纯度CD14+单核细胞，诱导出纯度较高的DCs，方法简便且用时较短，缺点是造价昂贵。

DCs是体内已知功能最强大的专职抗原呈递细胞（APC），是参与AS免疫反应的主要细胞之一，成熟的DCs较未成熟的DCs拥有更强的抗原呈递能力，ox-LDL可促进单核细胞来源的DCs成熟，成熟的DCs促进CD4+ T细胞分化，分泌与AS形成相关的细胞因子，参与AS斑块的形成及演变的过程[6,7]。

大量实验和临床研究表明，AS是一个慢性炎症性疾病，其发生发展的各个阶段几乎都有免疫反应的参与[8]。ox-LDL是AS斑块形成过程的免疫反应中的重要抗原，在适应性免疫过程中，APC通过表面的清道夫受体识别ox-LDL颗粒，摄取并加工后呈递在APC表面，再通过主要组织相容性复合体（MHC）分子激活血管壁中的T细胞，进而参与AS斑块的形成[6]。

IL-27是由α亚基p28和β亚基EBI3组成的异二聚体。IL-27由活化的树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞分泌，同时具有促炎和抗炎功能。它可以诱导初始CD4+T细胞分化为Th1亚群，起到促炎作用[9]。此外，它还促进IL-12诱导T细胞产生IFN-γ，并诱导Th1细胞的转录调节因子T-bet的表达[10]。IL-27也能起到抗炎作用，IL-27可诱导初始T细胞分化为1型T调节细胞（Tr1），并促进其分泌抗炎细胞因子IL-10[11,12]。

JAK-STATs信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的共同途径，介导包括细胞增殖，分化，迁移，凋亡和免疫调节等多种生物学反应[13]。IL-27通过激活JAK-STAT1/STAT3途径诱导T细胞分化，促进AS免疫反应进程[14,15]。

LOX-1是ox-LDL的特异性受体，属于c型凝集素家族的n型膜蛋白，在成熟及非成熟DCs、单核细胞和巨噬细胞等均有表达[16]。有研究表明LOX-1不仅在自发性高血压大鼠中高度表达，而且在高脂血症大鼠中也可表达，说明LOX-1在巨噬细胞和平滑肌细胞形成泡沫细胞的过程中起重要作用[17]。LOX-1在晚期动脉粥样硬化病变核心的血管中广泛表达，且能促进血管内皮细胞凋亡，说明LOX-1的表达上调是AS发生、发展多个环节中的重要组成部分，且与斑块破裂相关[18]。CD36是一类分布广泛、生物作用多样的清道夫受体，在AS斑块的脂核中聚集，而ox-LDL与单核细胞表达的CD36结合后，可激活单核细胞，促进炎症反应和氧化、凋亡等，加重了AS的发生发展[19,20]。

中医认为，胸痹心痛是由正气亏虚，痰浊、瘀血、气滞、寒凝阻滞而引起的心脉痹阻不畅，临床以膻中或左胸部发作性憋闷、疼痛为主要表现，常伴有心悸气短、呼吸不畅，甚至喘促、惊恐不安、面色苍白、冷汗自出等症状，多由劳累、饱餐、寒冷及情绪激动而诱发[21]。王显教授根据其病情发病急骤、病情变化多端、病程时作时止等特点，提出胸痹心痛络风内动病机学说，该学说认为冠状动脉粥样硬化斑块破裂、发生急性冠脉综合征的过程，符合“风善行而数变”的特点，属于“风证”范畴[3]。临床运用祛风通络法治疗胸痹心痛能够取得良好的临床疗效[22-26]。络风宁1号方以搜风通络药的地龙为君，祛风活血药徐长卿为臣，佐以活血定痛的三七和补虚息风的黄芪，加之开窍止痛的冰片为使，令全方共奏祛风通络、益气活血之功。临床试验也证实，络风宁1号方对冠心病不稳定型心绞痛有显著的临床疗效[27,28]。

综上所述，络风宁1号方可以通过抑制IL-27/JAK-STATs信号通路并降低可以与ox-LDL结合的LOX-1和CD36水平，抑制ox-LDL介导的DCs成熟过程。这可能是络风宁1号方抗AS的机制之一，下一步将从更多角度进一步探究络风宁1号方抗AS的机制，为中医药治疗AS提供新思路。