江岳鑫，华潞，韩璐璐，柴琳，严岩，蒋娟娟，刘红，田蕾，李一石

触珠蛋白-CD163-氧应激诱导型血红素加氧酶1（Hp-CD163-HO-1）通路是在生理和病理性溶血状态下避免游离血红蛋白（Hb）毒性的一种高效的捕获-受体-酶系统，其主要机制包括Hp-Hb清除以及Hb来源的血红素清除[1]。2型糖尿病（T2DM）合并冠心病（CAD）患者由于冠状动脉（冠脉）血管弥漫病变较多，狭窄程度较重，且支架术后再狭窄发生概率及死亡率均显著增加，所以备受重视。既往研究表明Hp 2-2型与T2DM患者发生CAD的风险[2]以及冠脉狭窄严重程度[3]密切相关，但并无其与冠脉病变复杂程度的研究报道，且其所在通路Hp-CD163-HO-1与T2DM患者CAD发生的相关研究并不明确，特别是基因交互作用未报道。故本文旨在研究Hp-CD163-HO-1通路中关键基因及交互作用与T2DM患者CAD的发生、发展的关联。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组 入选2010年～2015年于阜外心血管病医院行冠脉造影检查的T2DM患者共573例，其中男性390例，女性183例，年龄18～85岁。T2DM诊断依据为糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5%，或空腹血糖FPG≥7.0 mmol/L，或口服糖耐量试验时2 h血糖≥11.1 mmol/L。排除未行冠脉造影、无完整病历资料及糖耐量异常的病例。从入选患者中根据冠脉造影结果分T2DM合并CAD（T2DM+CAD）组（病变狭窄程度≥50%，n=301）及T2DM未合并CAD（T2DMCAD）组（冠脉狭窄程度＜50%，n=272例）；在T2DM+CAD组中，选择无既往事件、既往PCI/CABG史的作为SYNTAX组（n=131）。

1.2 方法

1.2.1 研究设计 记录其性别、年龄、体质指数（BMI）、吸烟史、饮酒史、糖化血红蛋白（HbA1c）等指标及SYNTAX评分。校正性别、年龄、HbA1c水平等，分析tagSNPs及其交互作用与T2DM患者CAD发生风险的关联；根据SYNTAX评分，分析tagSNPs及其交互作用与T2DM合并CAD病变复杂程度的关联。

1.2.2 位点分析 选取Hp-CD163-HO-1通路相关基因氧应激诱导型血红素加氧酶1（HMOX1）、血小板集落因子（PF4）、CD163、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（IFN-γ），基于下列条件，使用Hapmap#27选取tagSNPs：①上游5000 bp至下游5000 bp区域；②汉族（CHB或CAD）人群中最小等位基因频率（MAF）＞0.05；③连锁不平衡R2≥0.8。而后在上述tagSNPs中使用Haploreg V2（MIT，USA）和SNP Function Prediction（NIH，USA）筛选出具有潜在功能的tagSNPs。Hp基因分型采用二次PCR法[2]；SNPs检测采用Taqman荧光定量PCR法进行检测。Hp引物：①PCR1：P-F：A (5’-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3’)，P-R：B(5’-GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT-3’)；②PCR2：P-F：C (5’-CCTGCCTCGTATTAACTGCA CCAT-3’)，P-R：D (5’-CCGAGTGCTCCACAT AGCCATGT-3’)。其余SNPs探针来自美国Applied Biosystems公司。

1.3 统计学处理 所有数据均采用SPSS 24.0统计学软件分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间均数的比较采用t检验，计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。基因位点分析以Plink v1.07软件进行，计算位点频率、MAF、Hardy-Weinberg平衡（HW平衡）。用logistic回归分析T2DM±CAD组tagSNPs基因型与CAD的危险比；用线性回归分析SYNTAX组tagSNPs基因型与SYNTAX评分的关系；并分别纳入性别、年龄、BMI、吸烟史、高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、胰岛素使用及HbA1c水平作为协变量进行校正。基因交互作用分析采用广义多因子降维法（GMDR）进行。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较 两组患者年龄、BMI、合并高血压病、高酯血症比例比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。性别、吸烟史、胰岛素使用情况及HbA1c存在统计学差异（P均＜0.05），将在后续分析中进行校正（表1）。

表1 T2DM±CAD两组组间一般临床资料比较

2.2 Hp-CD163-HO-1通路基因SNP分布特点本研究筛选确定了16个位点作为tagSNPs，它们在T2DM±CAD组及SYNTAX组中的基因型分布特点见表2。T2DM±CAD组中Hp、rs2071748及rs2070874不符合HW平衡；SYNTAX组中Hp不符合HW平衡（P＜0.05）。不符合HW平衡的位点将在后续分析中排除。

2.3 Hp-CD163-HO-1通路基因SNP与T2DM患者并发CAD的相关性 在T2DM并发CAD风险上，CD163 rs11054072 GA型较AA型风险低（OR=0.69，95%CI：0.49～0.98，P=0.04），IL-4rs3756074 TT型较CC型风险更低（OR=0.11，95%CI：0.01～0.85，P=0.03）；而HMOX1 rs743811 TT型较CC型风险高（OR=2.06，95%CI：1.16～3.64，P=0.01）。在T2DM合并CAD的复杂程度上，HMOX1 rs743811 TC型较CC型（β=-3.76，95%CI：-7.31～-0.22，P=0.04）及IFN-γ rs2069705 AG型较GG型（β=-3.68，95%CI：-7.19～-0.17，P=0.04）分别表现出基因型与SYNTAX评分的负相关（表3）。

表2 Hp-CD163-HO-1通路基因SNP分布特点

校正协变量后，在T 2 D M并发C A D风险上，CD163 rs11054072 GA型较AA型风险更低（O R=0.6 9，9 5%C I：0.4 7～1.0 0，P＜0.05），IL-4 rs3756074 TT型较CC型风险更低（OR=0.11，95%CI：0.01～0.91，P=0.04）；而HMOX1 rs743811 TT型较CC型风险更高（OR=2.06，95%CI：1.13～3.75，P=0.02），与T2DM患者合并CAD相关；HMOX1 rs743811 TC型较CC型（β=-4.08，95%CI：-7.68～-0.48，P=0.03）及IFN-γ rs2069705 AG型较GG型（β=-3.92，95%CI：-7.39～-0.45，P=0.03）分别表现出与SYNTAX评分的负相关（表4）。

表3 Hp-CD163-HO-1通路基因型与T2DM患者CAD发生风险及病变复杂程度（未校正）

2.4 Hp-CD163-HO-1通路基因交互作用与T2DM患者并发CAD的相关性 校正的GMDR分析所示（表5），T2DM±CAD组间HMOX1 rs743811与IL-4 rs3756074存在交互作用（CVC 2/10，训练样本准确度57%，测试样本准确度44%）；同时HMOX1 rs743811、IL-10 rs1800871与IL-6 rs1800796三个位点间也存在交互作用（CVC 2/10，训练样本准确度61%，测试样本准确度45%），但均不能确定与T2DM患者CAD发生风险相关（P＞0.05）。SYNTAX组IFN-γ rs2069705与IL-10 rs3790622存在交互作用（CVC4/10，训练样本准确度67%，测试样本准确度42%），且与T2DM患者冠脉病变复杂程度相关（P＜0.05）；同时HMOX1 rs743811、IL-10 rs1800871与IL-6 rs1800796三个位点间也存在交互作用（CVC 4/10，训练样本准确度76%，测试样本准确度44%），并与T2DM患者冠脉病变复杂程度相关（P＜0.05）。

表4 Hp-CD163-HO-1通路基因基因型与T2DM患者CAD发生风险及病变复杂程度（校正后）

表5 Hp-CD163-HO-1通路基因位点交互作用的GMDR分析

3 讨论

本研究探索了Hp-CD163-HO-1通路基因及其交互作用与T2DM患者CAD发生及发展的关系，发现IL-6 rs1800796，HMOX1 rs743811与IL-10 rs1800871三个基因的交互作用与T2DM患者CAD病变冠脉病变复杂程度有关。

HW平衡是遗传学研究的基石[4,5]，为避免影响后续分析结果，本研究舍去了不符合HW平衡的位点。基因多态性结果显示，HMOX1 rs743811 TT型与T2DM患者CAD的发生及病变复杂程度均有明确相关性，且该位点同时存在于后续基因交互作用的模型中。以往HMOX1与CAD相关的报道主要见于其启动子区域的GT重复[6-8]，关于本位点的研究较少。

本研究在分析T2DM患者CAD发生风险的基因交互作用时，得到的两位点模型（HMOX1 rs743811和IL-4 rs3756074）及三位点模型（HMOX1 rs743811、IL-6 rs10800796和IL-10 rs1800871）均存在交互作用，其中后者训练样本准确度（0.61）和测试样本准确度（0.45）均高于前者（0.57，0.40），表明后者模型拟合更优，但因P＞0.05，并未得到统计学差异，且二者交叉验证一致性较低（2/10），意义不明确。在分析T2DM合并CAD患者冠脉病变复杂程度的基因交互作用时，得到的两位点模型（IFN-γ rs2069705和IL-10 rs3790622）和三位点模型（HMOX1 rs743811、IL-6 rs10800796和IL-10 rs1800871），二者交叉验证一致性均为4/10，模型拟合P值均小于0.05，说明二者均与T2DM患者冠脉病变复杂程度相关。后者训练样本准确度（0.76）和测试样本准确度（0.44）均略高于前者（0.67，0.42），证明了后者更优。本研究在分别分析T2DM±CAD组和SYNTAX组基因交互作用时，得到了相同的三位点模型（HMOX1rs743811、IL-6 rs10800796和IL-10 rs1800871），但仅在SYNTAX组中有统计学意义，值得在后续研究中验证。以往研究中，IL-6基因型与CAD是否存在确切关联，不同的研究结果仍存在分歧[9,10]。IL-10可以在动脉粥样硬化斑块形成过程表达，具有强动脉保护和抗再狭窄作用[11-13]，但现存的IL-10 SNP对动脉粥样硬化相关的临床研究结果存在争议[14,15]。结合本研究交互作用分析，既往研究结果中IL-6及IL-10对于CAD的不确切的研究结果可能与其存在基因交互作用相关，故今后类似研究还应考虑并进一步验证基因相互作用的影响。