董小莉，谭宁，马立宁，王苗，李斌，王圣，邓宇珺，符永恒

急性心肌梗死（AMI）是在冠心病的急症，再灌注治疗是治疗急性心肌梗死、减少死亡率、改善预后的最重要的手段之一，但是再灌注治疗时产生的心肌缺血再灌注损伤（IRI）严重影响了再灌注治疗的效果。如何减轻IRI是防治缺血性心脏病和临床心脏介入性治疗的一个重要课题。缺血预处理和缺血后处理是近年来研究的重点，尤其是药物后处理，因为其可操作性更强，可能具有的临床意义更大而被广泛研究。缺血心肌再灌注开始时产生活性氧（ROS），是引起缺血再灌注损伤的主要原因之一。在心肌再灌注时经预处理及后处理能减少ROS的产生而起到保护心肌的作用[1,2]。近年的研究发现，脑钠肽（BNP）在具有类似于缺血预处理和后处理的抗IRI的作用，可以通过环磷酸鸟苷环化酶[3,4]、一氧化氮合酶[5]等途径产生一系列心肌保护作用，如减轻再灌注后心肌抑顿，减少心梗面积及细胞凋亡等，亦有研究提示BNP也可能通过减少ROS的产生从而减轻IRI[6]，但尚未有研究具体的机制，本研究通过使用自由基清除剂2-巯基丙酰甘氨酸（MPG）阻断ROS途径，探讨BNP后处理降低心肌细胞凋亡的机制与ROS的关系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 TKR-200C型小动物呼吸机（江西省特力麻醉呼吸设备有限公司，中国）；Pclab-US生物医学信号采集系统（北京微信斯达科技发展有限公司，中国）；HFU-21低温冰箱（Therom公司，美国）；恒速泵（Terom公司，日本），DK-8D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司，中国），LRH-150B生化培养箱（广东省医疗器械厂，中国），冰冻切片机（Leica公司，德国），共聚焦显微镜（Leica公司，德国），数码相机 （canon公司，日本），紫外分光光度计（岛津，日本），Shangping JA12002 型电子天平（上海电子天平，中国），高速离心机（HETTCH公司，美国）。

1.2 实验动物及主要试剂 成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，体重为（300±50）g（中山大学动物中心提供）。大鼠BNP（脑钠肽，sigma-Aldrich，美国）；2-巯基丙酰甘氨酸（MPG，sigma-Aldrich，美国）；4，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI，创为世纪，中国）； TUNEL试剂盒（Roche公司，德国）；超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，丙二醛（MDA）测定试剂盒，组织总蛋白提取试剂盒，BCA法蛋白浓度测定试剂盒（南京建成生物医学工程研究所，中国）。其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 研究方法

1.3.1 实验动物分组 选用SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只（300±50）g，随机分成4组：S组、I/R组、BNP组及BNP+MPG组，各组间重量差异无统计学意义（F=0.969，P=0.416）。各组均于降支过线/结扎后10 min开始尾静脉恒速泵入相应药物直至再灌注结束。S组只在前降支下穿针过线，不结扎前降支，过线10 min后泵入生理盐水直至试验结束。其余各组均于结扎大鼠冠状动脉前降支后10 min开始经尾静脉恒速泵干预药物直至实验结束，其中S组泵入生理盐水，I/R组泵入生理盐水、BNP组泵入BNP 0.01 g/（kg·min）；BNP+MPG组泵入BNP 0.01 g/（kg·min）并在缺血25 min后经尾静脉弹丸注射MPG（20 mg/kg）。

1.3.2 大鼠在体心肌缺血-再灌流损伤模型建立根据参考文献[7-11]并加以改进建立大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型：大鼠术前禁食不禁水12 h后，氯胺酮70 mg/kg，安定7 mg/kg肌肉注射麻醉成功后于颈部及胸前区备皮并仰卧位固定于手术台，四肢连接心电图装置，记录心电图；经皮尾静脉置管，5000 U/kg肝素抗凝，连接恒速泵输液装置；消毒后于行颈部正中切口，钝性分离组织，游离气管后行气管切开插管，连接呼吸机（通气量3 ml/100 g，频率70～80 次/min）可见胸廓适度起伏，无呼吸困难，口唇处呈粉红色。消毒胸前区备皮部分，左胸骨旁约0.5 cm处从第3～5肋骨纵行剪开皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉直至有突破感，用自制开胸器撑开切口，暴露左心耳及左前降支，使用眼科剪剪开心包膜， 以左冠状静脉主干为标志，以6-0带针丝线沿在左心耳与肺动脉圆锥间穿针过线（进针深度1.5～2 mm，宽2～3 mm）， 将橡皮筋垫于进针点与出针点之间，将前降支连同橡皮筋一起结扎，持续35 min后沿橡皮筋剪开结扎线，关胸再灌注120 min，实验过程中持续心电监护，以结扎后ST段抬高0.2 mV为心肌缺血成功标志，以再灌注15 min内ST 段回落＞50%作为冠状动脉再通的指标。不符合上述心电图标准者剔除实验。S组仅在心脏相同部位过线，但不结扎。

1.3.3 取材与保存 再灌注结束后摘取心脏，冰浴中用4 ℃ PBS溶液冲洗，称取心脏重量（g），后于冰浴上剪去右心室及心房，称取左心室重量（g），自左前降支结扎线以下将左心室切成约2 mm厚的心肌片，第三片用于检测细胞凋亡，余部分用于检测SOD及MDA，分别装入2 ml离心管中，即刻投入液氮中速冻后将组织保存于-70℃冰箱。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 心肌组织SOD，MDA及组织蛋白浓度测定黄嘌呤氧化酶法测定SOD、MDA。-70℃冰箱中取出标本，称重量，加人适量冰冷生理盐水，冰上研磨成组织匀浆（1:10）。匀浆至无肉眼可见的组织颗粒，取0.1 ml组织匀浆用于测MDA，剩下的4500 g离心20 min，上清液为SOD抽提液。按照MDA、SOD试剂盒说明书配制试剂，测定各管吸光度。以组织裂解液提取心肌组织总蛋白，BCA法测定浓度。根据组织中SOD、MDA含量公式计算其活性或含量。

1.4.2 冰冻切片TUNEL法检测心肌细胞凋亡 采用末端脱氧核苷基转移酶介导的dUTP原位平端标记法（TUNEL）定量检测心肌细胞凋亡。检测方法简述如下：①心肌组织冰冻切片的制备：-70℃冰箱中取第三片心肌片，用组织包埋剂OCT包埋，冰冻切片机连续切片，每个标本连续切片2张，厚度3 μm，甲醇固定（大于30 s）后再保存于-70℃备检。②凋亡心肌细胞原位检测：冰冻切片4%多聚甲醛常温20 min ，PBS漂洗30 min，细胞通透液0.1%tritonX-100 4 ℃通透2 min，PBS漂洗2次，每次5 min，加预先混匀的TUNEL反应液（TdT 5 μl/份，dUTP 45 μl/份），37℃孵育30 min ，PBS洗3次，每次5 min，加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），4 min PBS漂洗3次，每次5 min，防荧光焠灭封片剂封片。阴性对照组仅加50 μl记的dUTP液。③心肌凋亡细胞计数：在激光扫描共聚焦显微镜下，所有心肌细胞核均呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈绿色。将两者叠加，则凋亡细胞核呈现蓝绿色。根据凋亡细胞核分布情况，每张切片于缺血再灌注损伤区域随机取5个非重叠400倍视野，计数凋亡细胞，并以百分数表示作为凋亡指数（AI），AI=凋亡阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.5 统计学分析 用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。所有实验数据均用均数±标准差表示，多组间比较使用单因素方差分析，有显著差异者用LSD检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SOD活力、MDA水平及AI 与S组对比，I/R组SOD活性显著下降，MDA含量显著增高，AI水平明显增加（P均＜0.05）；与I/R组对比，BNP组的SOD活性显著增加，MDA含量显著下降，AI水平明显降低（P均＜0.05）；与BNP组对比，BNP+MPG组SOD活性显著下降，MDA含量升高，AI水平明显增加（P均＜0.05）。与I/R组对比，BNP组的SOD活性显著增加，MDA含量显著下降，AI水平明显降低（P均＜0.05）；与BNP组对比，BNP+MPG组SOD活性显著下降，MDA含量升高，AI水平明显增加（P均＜0.05）。各组大鼠的组SOD活力、MDA水平及AI的测定结果见表1 。

2.2 各组心肌细胞凋亡 心肌冰冻切片TUNEL染色，激光扫描共聚焦显微镜下拍照（400×）。每组图片的第一张均显示DAPI蓝色荧光，所有细胞核均显色；第二张ITC-dUTP标记显示绿色荧光，仅凋亡细胞核显色；第三张为前两图重叠图，凋亡细胞呈现蓝绿色荧光，正常细胞呈现蓝色荧光。S组（图1-1）仅有数个凋亡细胞，I/R组（图1-2）可见大量凋亡细胞，BNP组（图1-3）凋亡细胞较I/R组明显减少，BNP+MPG组（图1-4）凋亡细胞较BNP组明显增多，各组AI水平差异有统计学意义（P＜0.001），较S组，其余三组AI水平均显著增高（I/R组P＜0.001；BNP组，P=0.021；BNP+MPG组，P＜0.001）；BNP组AI水平较BNP+MPG组低（P=0.001）。

表1 各组MDA、SOD活力及AI

3 讨论

图1 TUENL法检测心肌细胞凋亡

急性心肌梗死患者在心肌再灌注治疗（溶栓、急诊PCI或CABG）过程中发生心肌缺血再灌注损伤从而有可能导致恶性心律失常、心肌损伤标志物的增加、心脏功能的下降甚至是死亡，这是临床医生常常要面临的问题。心肌缺血再灌注损伤一直以来都是临床上需要面临的问题，急性心肌梗死患者在心肌再灌注治疗（溶栓、急诊PCI或CABG）过程中发生恶性心律失常及心肌再灌注治疗之后的心肌损伤标志物的增加，由此将导致患者心脏功能下降甚至是死亡，这些均是临床医生常常要面临的问题。多年来，为了降低这种因为缺血再灌注损伤而导致的不良后果，科研人员和临床医生进行了大量的研究，尤其是对心肌缺血再灌注损伤的机制进行了广泛深入的研究，提出多种可能的机制及理论，如氧化应激，钙超载，细胞能量代谢障碍而导致的代谢紊乱，血管内皮的损伤等[12-16]，其中氧化应激是造成心肌缺血再灌注损伤的重要原因之一，而既往有研究提示ROS是导致氧化应激导致心肌缺血再灌注损伤的环节中扮演重要角色。 ROS是细胞代谢过程产生的具有极高化学反应活性及不稳定性的的电子、原子等，极易与某些化合物发生过氧化反应，损伤细胞超微结构，主要包括羟自由基、过氧化氢和超氧阴离子。正常情况下，这类产物数量较少，参与正常的代谢过程，而且机体本身有清除机制（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶及维生素等），可以使其含量保持动态平衡状态而免受其毒性危害。心肌缺血再灌注时大量的ROS呈现爆发式产生，从而造成ROS在体内的蓄积，ROS可以通过使大量的白细胞在心肌毛细血管聚集并活化，增强中性粒细胞的趋化性、直接破坏心肌细胞核酸的核糖、影响细胞膜的流动性、离子通道的功能、细胞膜通透性等使心肌细胞功能受损，甚至直接破坏心肌细胞核素的核糖导致心肌细胞死亡等方式导致心肌缺血再灌注损伤[17,18]。因此，在心肌梗死发生后，针对ROS的靶向性治疗，不仅能够改善缺血再灌注损伤造成的心肌细胞功能异常，也能够改善心肌梗死的预后。本研究为探讨BNP对心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡的保护作用是否与ROS有关而设计。而SOD活性的增高意味着抗ROS能力增强，而MDA水平的下降意味着因为ROS产生的损伤减轻，反之亦然，因此本研究通过检测SOD活力及MDA水平从而间接检测ROS水平。

本研究结果提示较之I/R组，BNP组的SOD活性显著升高，MDA水平显著下降，心肌细胞AI明显降低，提示BNP对缺血再灌注心肌具有的保护作用，这与我们以往的研究结果一致[6]，而与BNP组相比较，BNP+MPG组SOD活性显著降低，丙二醛水平显著增加，心肌细胞AI明显升高，提示MPG阻断ROS途径后，BNP对缺血再灌注心肌的保护作用下降，因此，BNP对缺血再灌注心肌产生保护作用的机制与对ROS水平有关，当然，更为深入的研究尚需继续进行，但这个发现为急性心肌梗死缺血再灌注损伤的治疗提供了一个新的潜在治疗方法。