唐兴贵 陆新莉 雷庭 郭光东 江彤 丁婷

摘要    在前期筛选出高效防治烟草青枯病的生防菌株的基础上，于贵州省黔南州独山县开展田间小区试验，分析生防菌剂施用对根际土壤微生物菌群数量变化的影响。结果表明，烟草内生菌LSN02和烟草根际菌LLGJ04等2种生防菌剂在烟草种植中的施用均可明显提高根际土壤微生物的菌群总数量，且LSN02的效果优于LLGJ04;其中，用烟草内生菌LSN02高浓度（2×108 CFU/mL）处理烟株时，可显著增加根际土壤细菌菌群数量，而用烟草根际菌LLGJ04中浓度（1×108 CFU/mL）和低浓度（0.5×108 CFU/mL）处理烟株时，可分别增加根际土壤放線菌及真菌的菌群数量。

关键词    微生物菌剂;根际土壤;真菌;细菌;放线菌;烟田

中图分类号    S572.01        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）22-0086-03                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）

烟草是贵州省重要的经济作物。近年来，由于烟草多年连作、农业生态平衡遭到破坏等原因，导致贵州主要烟区青枯病危害日趋严重，成为影响烟草产业发展的主要障碍[1-3]。化学农药的使用在烟草病害防治上发挥了重大作用，很多病害得到了暂时控制，但化学药剂的大量持续性使用易造成病原菌抗药、环境污染、生态失衡、药害植株和烟叶农药残留等难以克服的问题，不利于生态环境的保护和农业可持续发展[4]。随着农作物病害防治技术的进步，烟草青枯病的生物防治日益引起社会的重视。目前，围绕烟草植物内生菌及其根际微生物控制烟草青枯病已成为研究的热点和重点[5-8]。

微生物菌剂是指一类含有特定微生物活体的制品，可通过其所含微生物的生命活动，改善土壤质量，协调植株对养分的吸收，促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境[9-10]。本课题组前期研究中，自贵州省黔南州烟区的健康烟株及根际土壤中分离获得2株对烟草青枯病菌具有较好拮抗活性的菌株LSN02和LLGJ04，其盆栽试验均表明烟草内生菌LSN02和烟草根际菌LLGJ04均可有效增强烟株对青枯病的抗病能力[11]。因此，该试验拟在前期筛选出高效防治烟草青枯病害生防菌株的基础上，通过田间试验比较生防菌剂施用对土壤微生物数量以及微生物功能多样性的影响，以期为提高植烟土壤有机养分含量和微生物活性提供依据。

1    材料与方法

1.1    试验地概况

试验在贵州省黔南州独山县开展，选择2017年土传病害重病地自然诱发。试验地面积≥1 333.34 m2，田块形状相对较规则，基本呈长方形。常规条件栽培，土壤肥力中等，生产措施按常规管理实行。

1.2    试验材料

1.2.1    供试烟草品种。选择当地主栽烟草品种云烟87，共计2 000株。

1.2.2    供试菌株。选用本实验室前期分离的2株对烟草青枯病菌具有较好拮抗活性的烟草内生菌LSN02和烟草根际菌LLGJ04，均为芽孢杆菌属微生物。

1.2.3    供试微生物菌剂和化学药剂。100亿CFU/g多粘类芽孢杆菌（500 g/袋），由厦门多多科技有限公司生产;农用链霉素可溶性粉剂（15 g/袋），由华北制药河北华诺有限公司生产。

1.2.4    供试培养基。PDA培养基（分离真菌用）：马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，水1 L。NA培养基（分离细菌用）：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.5。改良高氏一号培养基（分离放线菌用）：购自试剂公司。

1.3    试验设计

设9个处理，即烟草内生菌LSN02 0.5×108 CFU/mL灌根处理（A）、烟草内生菌LSN02 1.0×108 CFU/mL灌根处理（B）、烟草内生菌LSN02 2.0×108 CFU/mL灌根处理（C）、烟草拮抗菌LLGJ04 0.5×108 CFU/mL灌根处理（D）、烟草拮抗菌LLGJ04 1.0×108 CFU/mL灌根处理（E）、烟草拮抗菌LLGJ04 2.0×108 CFU/mL灌根处理（F）、100亿CFU/g多粘类芽孢杆菌细粒剂2 700 g/hm2灌根处理（G）、72%农用链霉素可湿性粉剂750 g/hm2灌根处理（H），以清水灌根处理作对照（CK）。3次重复，随机区组排列，每次重复植烟50株，共处理1 350株。

1.4    试验过程

1.4.1    土样采集。烟苗移栽时先蘸根，坑内灌入100 mL药剂后再移栽，移栽后15 d左右在封窝前按同等浓度再灌1次。于烟草青枯病病情调查时采集土样，每个小区3点取样，采集烟株根系周围土样，每个样本采集带须根土壤50 g，牛皮纸袋装土样，带回实验室备用。

1.4.2    土壤微生物分离。称取样品10 g（精确到0.01 g），加入带玻璃珠的100 mL无菌水中，静置20 min，在旋转式摇床上200 r/min充分振荡30 min，即成土壤母液。用无菌移液管分别吸取5.0 mL上述土壤母液菌悬液，加入45 mL无菌水，按10n的比例进行系列稀释，依次得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释倍数的土壤悬浮液。

每个样品取3个连续适宜的稀释度，分别吸取不同稀释度土壤悬浮液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用涂布棒在培养基表面将悬浮液来回推散涂抹均匀。每一个稀释度3次重复，于适宜的条件下培养。

细菌培养24 h后计数，真菌培养72 h后计数，放线菌培养7 d后计数。以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，统计分离到的活菌数目。

2    结果与分析

2.1    不同处理烟田土壤中细菌的分离数量

如表1所示，不同处理烟田土壤中分离到的细菌数量有一定差异，细菌数量由多到少依次为处理C>处理F>处理E>处理B>处理D>处理A>处理G>处理H>CK。处理A、B、C、D、E、F的烟田土样分离到的细菌数量均高于处理G、H、CK，且处理A、B、C效果较为明显。由上述结果可知，将2种微生物菌剂添加到土壤中，在一定程度上均可引起烟田土壤细菌菌群数量的增加。

2.2    不同处理烟田土壤中放线菌的分离数量

如表1所示，不同处理烟田土壤中分离到的放线菌数量差异较大，数量最多的是处理E，分离到的放线菌数量为3.27×106个/g;其后依次是处理F、B，分离到的放线菌数量分别为2.37×106个/g和2.27×106个/g。与此同时，处理A、C、G、H等4个处理组分离到的放线菌数量均低于CK，处理H的土壤中放线菌数量仅为0.37×106个/g。由此可知，处理F、E、B均能增加土壤中放线菌数量，其中处理E效果最为明显。

2.3    不同处理烟田土壤中真菌的分离数量

如表1所示，不同处理烟田土壤中分离到的真菌数量以处理G最多，为3.77×106个/g;其后依次是处理D>处理B>处理E>处理C>处理H>处理A>处理F>CK。由此可知，高浓度微生物菌劑的添加，在一定程度上抑制了土壤中真菌的生长，随着菌剂浓度的降低，土壤中的真菌数量相对于CK反而增加，表现为处理D、B对根际土壤的真菌含量有明显的增加效果。

2.4    不同处理烟田土壤中分离的微生物总数量

如表1所示，处理C样品中分离到的微生物总量最高，数量为2.78×107个/g，其后分别为处理F、E;而处理H土壤中分离到的微生物总数量则低于CK及其他各处理，说明微生物菌剂的添加可明显增加根际土壤的微生物菌群数量，而化学药剂的施用在一定程度上对土壤中的微生物群落起到破坏作用。

3    结论与讨论

近年来，随着化学肥料在作物生产中引起的土壤板结、土壤微生物区系失衡、土传病害发生及环境污染等问题的日益加重[12]，微生物菌剂在农业上的作用已逐渐被人们认识，并有多种微生物菌剂，如蜡质芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌以及哈茨木霉等的开发应用。大量研究表明，微生物菌剂可通过其有效微生物的生命活动增加土壤养分、促进作物生长、维持根际间微生物区系平衡，可以通过微生物之间或与植物之间的互作增强植物的抗病与抗逆能力。该研究在前期筛选出高效防治烟草青枯病的生防菌株的基础上，通过田间试验比较生防菌剂施用对土壤微生物数量以及微生物功能多样性的影响，发现烟草内生菌LSN02和烟草根际菌LLGJ04 2种生防菌剂在烟草种植中的施用均可明显提高土壤微生物的菌群总数量。结合前期研究，LSN02具有趋化特性，用中浓度（1×108 CFU/mL）、高浓度（2×108 CFU/mL）的LSN02菌株处理烟株，烟草青枯病的病株率显著低于LLGJ04菌株不同浓度处理组[11]。因此，推测将烟草内生菌LSN02施用到烟草根部，LSN02能快速向根系移动，通过增加植株根际土壤中的细菌菌群数量，从而与青枯病菌进行空间及营养等方面的竞争，反映到外部症状上，即LSN02菌剂的施用可明显减轻烟草植株青枯病的发病率。

土壤微生物是土壤生物特性的重要组成部分，在土壤营养转化循环、有机质分解等方面起着重要作用，是土壤肥力的一个重要指标，其数量变化可反映出土壤环境变化，体现微生物活性变化。该研究中，微生物菌剂的添加能明显增加植烟土壤中微生物数量。究其原因，将微生物菌剂添加入烟草根际，随着微生物的生长代谢，在一定程度上改变了土壤中的C/N比值，间接影响土壤微生物生长繁殖，反映在土壤微生物的分离结果上则是施入微生物菌剂的烟草土壤分离到的真菌、细菌以及放线菌含量均有不同程度的增加。

4    参考文献

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