何思思 邢时云 张大权 王彦哲 苟小霞（通讯作者）

（1 遵义医科大学第二附属医院肿瘤科 贵州 遵义 563003）

（2 遵义医科大学第二附属医院放疗中心 贵州 遵义 563003）

肺腺癌作为非小细胞肺癌重要类型，致死率高，疾病进展迅速，严重威胁人类健康[1-3]。肺腺癌一半以上的患者被诊断为无法治愈的局部晚期或转移性疾病。近年来，免疫治疗在肺癌中取得重大进展，其中，靶向PD1-PDL1 途径成为治疗非小细胞肺癌的研究热点。如今，免疫相关药物已被批准并应用于临床，例如PD-1 抑制剂（nivolumab 和pembrolizumab）和PD-L1 抑制剂（atezolizumab 和durvalumab）[4-6]。但是，只有15%-20%的患者有效。含趋化因子样因子（CKLF）样的MARVEL 跨膜结构域蛋白6（CMTM6）是一种广泛表达的蛋白，已被明确鉴定可调控PD-1 表达。作为癌细胞中作为PD-L1 蛋白的关键调节剂，CMTM6可以与PD-L1 结合并阻止PD-L1 靶向溶酶体介导的降解，从而增强了对免疫系统的抑制作用并成功逃脱了免疫监视。另外，CMTM6 可能参与表观遗传调控，胚胎发育和肿瘤发生。CMTM6 被报道与免疫相关，且CMTM 家族蛋白影响临床预后[7-10]。上述所有研究都是在细胞和遗传水平上进行的。肺腺癌中存在EGFR 突变率高，且EGFR 状态和患者生存密切相关。本文旨在初步探究CMTM6 在肺腺癌中表达情况以及该蛋白表达与不同EGFR 状态是否存在相关性，以期为进一步研究提供参考。

1.资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2015 年1 月—2018 年12 月期间的32 例非小细胞肺癌患者的石蜡肺组织标本，均未接受过放化疗。32 例患者包括28 例男性患者和4 例女性患者。其中临床分期为I/II 期占12 例，III/IV 期占20 例。EGFR 突变患者占10 例，EGFR 野生型患者为22 例。实验试剂：CMTM 6 抗体 (Abcam ab198284)，兔二抗(中杉金桥，PV-9001)，抗原修复液(柠檬酸三钠缓冲液)，湿盒，DAB 显色试剂盒(中杉金桥，ZLI-9018)，苏木素(上海展云化工 170103)，中性树胶 (中国上海懿洋41-91)。倒置拍照显微镜(OLYMPUS IX71)。

表1 CMTM6 表达与临床病理变量之间的关系（n=32）

1.2 免疫组化方法

脱腊：将组织切片放入二甲苯浸泡20min，反复2 次。复水：将切片一次放入到放有100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各3min。抗原修复：将切片浸入抗原修复液中，96℃共孵育5min。PBS 漂洗三次。内源过氧化物酶灭活：3% H2O2/PBS 室温孵育10min，PBS 漂洗5min，重复三次。封闭：5%BSA 封闭液，室温封闭1h。一抗：加入1% BSA稀释的一抗CMTM 6 (1：50，兔抗)，4℃过夜孵育。洗片：用1ml 移液枪在切片表面加2ml PBS 洗涤，重复3 次，每次5min。滴加反应增强液：滴加100μl 的反应增强液，室温孵育20min。洗片：用1ml 移液枪在切片表面加2ml PBS洗涤，重复3次，每5min。滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物：滴加100μl 的增强酶标山羊抗兔IgG 聚合物，室温孵育20min，PBS 洗涤重复3 次，每5min。显色：在切片的组织部分用200μL移液器加入50μL DAB 显色液，显色5min；流水冲洗5min。复染：滴加1 滴苏木素至切片的组织上，作用1min，流水冲洗3min。封片：待切片风干后，在切片上加1 小滴中性树胶，盖上盖玻片，封片。观察：进行显微镜观察并选取阳性表达部位拍摄100 倍和200 倍照片。

1.3 病理评分方法

由病理科医师读片证实病理诊断。免疫组化染色结果由两位高年资病理医师在双盲情况下独立检测，每张切片随机取5 个视野求得均值。以“染色强度评分”和“肿瘤细胞染色阳性率”的乘积为总评分。

1.4 统计学方法

通过SPSS 统计学分析，应用χ2检验与相关分析（逐一将分类变量与CMTM6 表达行χ2检验，P＜0.05 表示两个分类变量具有相关性）

2.结果

如图1A 中所示，CMTM6 蛋白在肺腺癌患者标本中存在显著差异。32 例肺腺癌组织中，CMTM6 阳性表达率为59.4%（19/32），占有病例数一半以上。

图1A

图1B

其中病理评分大于9 分占5 例，6 ～9 分占14 例（图1B）。见表1 中所示，通过SPSS 统计学分析，应用χ2检验与相关分析（逐一将分类变量与CMTM6 表达行χ2检验，P＜0.05两个分类变量认为具有相关性），结果提示CMTM6 的表达与患者的性别、年龄、是否吸烟、淋巴结播散情况和临床TNM 分期无相关性(P＞0.05)，与EGFR 突变与否无关(P＞0.05)，与病理分级相关(P＜0.05)。

3.讨论

CMTM6 作为CMTM 家族的成员，作为新的肿瘤调节因子，在人体免疫、男性生殖和造血系统中均发挥着重要作用。已有研究报道CMTM1 影响非小细胞肺癌的细胞增殖并导致肿瘤发生。CMTM2 可作为雄性生殖的关键蛋白，先前的研究发现CMTM2 在涎腺腺样囊性癌的肿瘤转移发展中起着重要作用。CMTM3 可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。2017 年，CMTM4 和CMTM6 同时被确定为PD-L1 蛋白调节剂。据报道，CMTM6 可以增加PD-L1 蛋白库而不会影响PD-L1 转录水平。CMTM6 可以与PD-L1 蛋白缔合，减少其泛素化并延长PD-L1 的半衰期。此外，CMTM6 可以维持PD-L1 的表达，并防止PD-L1 靶向溶酶体介导的降解。通过减少PD-L1，CMTM6 的耗竭显着减轻了体内外肿瘤特异性T 细胞活性的抑制。

目前，阻断PD-1/PD-L1 途径是晚期NSCLC 的标准二线治疗。考虑到CMTM6 在PD-L1 中的关键调节作用，值得研究CMTM6 和CMTM6 在非小细胞肺癌中的临床意义。迄今为止，仅在组织病理学水平上研究了CMTM6 与PD-L1 之间的关系。此外，最近的一项研究评估了35 例NSCLC 患者的癌组织，结果表明CMTM6 表达与P D-L1 表达呈正相关（P=0.044）。而腺癌中存在大量EGFR 突变，我们也同时想探究CMTM6 表达是否与该基因状态有关。

综上所述，CMTM6 在肺腺癌中表达存在显著差异，一半以上的患者样本CMTM6 有表达。但CMTM6 与EGFR 突变无明显相关性，但这一结果可能与样本量有限相关。本文提示CMTM6 可能与病理分级相关，这有待于更大样本的验证，我们也将从更多样本及基础研究中寻找进一步结果。