儿茶素/壳聚糖复合膜的抗氧化性分析

2020-12-10郭梅英夏彩芬

湖北工程学院学报 2020年6期

郭梅英，佘亮，夏彩芬

(湖北工程学院化学与材料科学学院，湖北孝感 432000)

壳聚糖(CS)是一种具有聚阳离子弱碱性质的多糖，是由甲壳素在强碱条件下，脱去乙酰基制备而来[1]。CS主要来源于虾、蟹类动物外壳，是纯天然可再生、对生物体无害的生物质资源，因其具有抗菌抑菌性、无毒性、生物相容性和成膜性等优良性能，在生物医药、食品保鲜和化妆品等领域得到广泛的应用[2-3]。但CS的抗氧化性能一般，使得CS复合膜在面膜材料方面的发展受到一定的阻碍。在CS中加入聚乙烯醇(PVA)作交联剂可制得具有一定机械强度的CS复合膜，该复合膜是目前护肤面膜的主要材料之一。

儿茶素又称儿茶酸，主要来源于茶叶之中，其属于黄烷醇类化合物，是茶多酚类物质的主要成分。儿茶素类物质根据碳环的结构类型不同，可分为以下4种结构：表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)[4-5]。儿茶素的分子链上含有很多活性酚羟基，能与人体中因为新陈代谢而产生的自由基反应，使自由基失去氧化性而稳定下来，防止自由基氧化人体组织器官和细胞使其失去原有的功能，因此儿茶素的抗氧化性很强，被广泛应用于生物医药领域中[6]。儿茶素的提取方法主要有4种，分别是溶液浸提法、超声波提取法、微波提取法和酶提取法。实验室常用的方法是溶液浸提法，这种方法操作简单，成本低廉，但提取到的儿茶素纯度不高，易被氧化，后期还需多次除杂提纯。虽然儿茶素被广泛应用于医药保健和食品保鲜领域，但是它在护肤面膜方面的研究却较为少见。

在当今社会，随着人们生活水平和美容护肤意识的不断提高，人们对自身皮肤的护理和保养意识越来越强。面膜作为美容护肤营养物质的一种载体，通过直接覆盖到皮肤上将面膜中的营养物质作用于皮肤，起到补水保湿、美白的效果而深受人们的喜爱[7]。近年来，受到环境恶化和电磁辐射的影响，皮肤老化速度加快，人们对面膜的要求不断提高，具备抗氧化性、抗衰老功能的面膜越来越具有市场竞争力。

本研究把不同质量的儿茶素添加到CS复合膜中，分析复合膜的吸湿透湿性和消除活性自由基的效果，探究儿茶素应用到面膜材料中的可行性，为儿茶素广泛应用于护肤面膜领域提供参考。

1 实验步骤

1.1 材料与仪器

主要实验药品：壳聚糖(低粘度)，分析纯，上海瑞水生物有限公司；聚乙烯醇(PVA)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；儿茶素，纯度>98%，大连美仑生物技术有限公司；双氧水，纯度 ≥ 36%，国药集团化学试剂有限公司；结晶紫，分析纯；国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，分析纯，天津市东丽区泰兰德化学试剂厂；DPPH，纯度>97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；焦性没食之酸，分析纯，天津博迪化工股份有限公司。

主要实验仪器：SQP电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；DF-101S磁力搅拌器，河南予华仪器设备有限公司；SHZ-D循环水多用真空泵，巩义市科华仪器设备有限公司；DZF-6050真空干燥器，上海索普仪器有限公司；JSM-6510扫描电子显微镜，日本电子株式会社；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-5013型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 PVA/CS铸膜液的优化

将PVA/CS总质量控制在2 g，分别按照不同质量分数的PVA(5%、10%、15%、20%、25%)称取不同量的PVA和CS，用 50 mL的去离子水，在磁力搅拌器下的85 ℃恒温油浴中，溶解PVA。用100 mL的1%冰醋酸溶液，采用同种方法，在55 ℃恒温油浴中磁力搅拌2 h，溶解CS，且冷却CS溶液后用3层纱布过滤，从而保证除去其中不溶性杂质。随后，将配置好的不同比例的PVA、CS溶液共混，再放入55 ℃的恒温磁力搅拌器中油浴1 h。

分别取上述不同质量比的混合液25 mL平铺到有机玻璃模具中，以流延法使其流至整个底部，放置在真空干燥箱中脱去铸膜液中的气泡，脱后再放置于35 ℃烘箱中烘烤8 h，待其成膜后从模具上将其揭下，放在干燥通风的环境晾干，之后再放入扫描电镜中，观察PVA/CS膜的表面形貌，判断二者的相容性，选择最合适的配比，进行下一步试验。

1.3 儿茶素/CS复合膜的制备

根据上述步骤选出PVA/CS铸膜溶液的最佳配比，在PVA/CS最佳配比的铸膜溶液中添加不同比例的儿茶素，其质量分数依次为0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，儿茶素/CS混合溶液依次命名为Q1、Q2、Q3、Q4、Q5，将所得不同比例的儿茶素/CS混合溶液放入35 ℃的磁力搅拌器中搅拌0.5 h，量取25 mL的混合液，注入10 cm×10 cm有机玻璃模具中，将其铺平，涂抹均匀，真空脱泡后置于35 ℃的真空干燥箱内烘10 h。

1.4 复合膜表面结构分析

将复合膜剪成适合大小的条状，用导电胶固定在样品盘上，再将其置于喷金仪中喷金，喷金后置于扫描电镜中，观察样品的表面形貌特征，分析复合膜的分散效果。

1.5 吸湿性分析

将儿茶素/CS复合膜裁成20 mm×20 mm的样条，称量样条的初始质量M1，在室内温度为15 ℃的条件下，在两个干燥器底部放入无水氯化钙，再分别放入氯化镁和氯化钾饱和盐溶液，维持干燥器的相对湿度(RH)分别为33%和85%，将样条置于两个相对湿度不同的干燥器中，放置0.5 d、1 d、1.5 d、2 d、2.5 d，称量各个时间段样条的质量M2，用公式(1)计算复合膜吸湿率(%)[8]。

(1)

1.6 透湿性分析

水蒸气的透过率及透湿性也是面膜材料的一个重要指标，对复合膜进行透湿性测试，选择5个形状、大小和质量都相同的试剂瓶，在试剂瓶内放置三分之一厚度的无水氯化钙，再在试剂瓶口均匀涂抹凡士林，将复合膜(20 mm×20 mm)紧贴在试剂瓶上将其密封，称量试剂瓶的重量，然后置于相对湿度为70%、温度为25 ℃的环境中，使膜两侧的蒸气压保持稳定，每隔1 h测量1次试剂瓶的重量，共记录8组数据[9]，用公式(2)计算水蒸气透过率WVP(%)[10]。

(2)

式中：WVP为水蒸气透过率(g/(d·m2))，△m为测试瓶质量的变化(g)，A为膜面积(m2)，t为时间(h)。

1.7 抗氧化性能分析

1.7.1 清除DPPH·的能力

配制pH 7.3的PBS缓冲溶液。准确称取一定量的DPPH，加入80 mL无水乙醇，配成0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液。分别量取4 mL的pH 7.3的PBS和4 mL的0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液于10 mL的离心管中，将复合膜裁成35 mm×15 mm的样条置于离心管中，25 ℃恒温震荡摇匀，在日光灯下反应0.5 h ，在紫外-可见光区的最大吸收波长处测量溶液的吸光度[11]。用公式(3)计算对DPPH·的清除率k(%)[12-13]：

(3)

式中：A0为纯DPPH溶液的吸光度，A1为复合膜作用后的吸光度。

1.7.2 清除羟基自由基(·OH)的能力

吸取1 mL浓度为0.4 mmol/L的结晶紫溶液于10 mL的离心管中，先后分别加入5 mL的pH为7.3的PBS溶液、1 mL的1 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL的6%H2O2及裁好的35 mm×15 mm复合膜样条，在25 ℃环境下恒温震荡30 min，使其充分反应，最后在紫外-可见光区的最大吸收波长处测定其溶液的吸光度，用蒸馏水做空白样品作为对照，根据公式(4)计算清除率k(%)[14-15]：

(4)

式中：A为复合膜和·OH作用后的吸光度，A1为复合膜的吸光度，A2为蒸馏水的吸光度

量取50 mL Tris碱溶液和22.9 mL的0.1 mol/L HCl于100 mL容量瓶中，加入去离子水配制成100 mL的pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液，向10 mL的离心管中加入8 mL pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液和裁好的膜样条(35 mm×15 mm)，在25 ℃下恒温震荡20 min，再加入0.1 mL45 mmol/L的焦性没食子酸，迅速摇晃均匀溶液后倒入比色皿中，在最大吸收波长处测样品溶液的吸光度A1，用蒸馏水作为空白试样测吸光度A0，每隔30 s测1次，共测8组数据，分别做样品溶液和对照溶液的吸光度随时间变化的线性方程[16]，方程模式为A=kt+b，A为吸光度，k为自氧化速率，t为放置时间，对应的自氧化速率分别为和k1和k0,相关系数R2，根据公式(5)计算清除超氧阴离子的能力k(%)：

(5)

2 结果与分析

2.1 PVA/CS铸膜液最佳配比的测定

将复合膜处理好后放入扫描电镜中，放大1000倍，观察其表面形貌，发现复合膜中PVA所占质量分数为15%时二者的相容性最好，因此选择这样配比的铸膜液作为下面实验的基底铸膜液(PVA/CS复合膜SEM图像未给出)。

2.2 儿茶素/CS复合膜表面形貌分析

将复合膜放入扫描电镜中，在1000倍的状态下，可以清楚地看到复合膜Q1、Q2、Q3、Q4、Q5的表面形貌，如图1所示(不含截面图)。

图1 复合膜的SEM图

由SEM图像发现，空白试样Q1表面比较平整，表面空隙较少，说明PVA和CS相容性较好，当分别加入质量分数为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的儿茶素后，复合膜Q2、Q3、Q4、Q5表面依旧非常平整，这说明儿茶素在复合膜中分散效果很好，且儿茶素的加入几乎不影响复合膜的表面形貌。

2.3 吸湿性分析

儿茶素加入到CS溶液中，可以让壳聚糖的亲水基团和水分子形成氢键，大大提高了壳聚糖的吸湿性。图2和图3为儿茶素/CS复合膜在低湿度和高湿度下，吸湿性随时间和儿茶素含量的变化图，儿茶素的加入，有利于提高壳聚糖中亲水基团的能力。由图2可知，在相对湿度为33%时，样品吸湿率大小为Q3>Q5>Q4>Q1>Q2，随着样品放置时间逐渐变长，复合膜总体的吸湿率是先提高后降低，由于加入的儿茶素含量较少，不同儿茶素比例的复合膜吸湿率变化幅度不是特别明显，在60 h时，各样品的吸湿率都逐渐靠近。其中的Q3在放置36 h时，吸湿率达到最高7.8%。即儿茶素质量分数为0.4%时，儿茶素/CS复合膜在低湿度下的吸湿性最好。

图2 复合膜吸湿率随时间的变化(RH 33%)

图3 复合膜的吸湿率随时间的变化(RH 85%)

由图3可知，在相对湿度为85%，样品吸湿率大小为Q4>Q5>Q2>Q3>Q1，在高湿度下复合膜的吸湿率逐渐增加，放置48 h时，Q4的吸湿率达到最大6.79%，且放置60 h后吸湿率变化不大。因此儿茶素质量分数为0.6%时，儿茶素/CS复合膜的吸湿率最佳。

2.4 透湿性分析

面膜中含有大量水分，但在使用过程中水分会被蒸发掉一部分，因此面膜材料应具有较低透湿率，才能使面膜能有效地锁住水分，降低营养物质的流失，从而提高敷面效果。不同比例的儿茶素对复合膜的水蒸气透过率如图4所示。

图4 复合膜随时间变化的透湿率

从图4中可以看出，空白试样Q1的水蒸气透过率最大，加入儿茶素之后，水蒸气透过率显著下降，Q2对水蒸气阻隔效果最好，由此可知儿茶素加入到复合膜后能使复合膜的水蒸气透过率显著减小。水蒸气透过率的大小为Q1>Q4>Q5>Q3>Q2，但是当儿茶素含量进一步增加时，水蒸气透过率有微弱的上升趋势，主要原因是随着儿茶素量不断增加，复合膜的紧密结构被破坏，分子间开始变得疏松，对水蒸气的屏蔽作用变弱。因此儿茶素质量分数为0.2%时，儿茶素/CS复合膜的保湿效果最好。

2.5 抗氧化性能测定

自由基来源于人体各个部位正常新陈代谢，适量的自由基对人体不会有太大的危害，但当自由基过多时，就会加速细胞凋亡，诱导细胞癌变，引发一系列的疾病，因此人体需要摄入抗氧化剂来消除多余的自由基。自由基的种类主要有羟基自由基、含氮自由基和超氧自由基，用儿茶素/CS复合膜分别对这3种自由基进行抗氧化分析，分析不同质量分数的儿茶素/CS复合膜对自由基的清除效果。

2.5.1 清除DPPH·的能力

DPPH·是很稳定的一种经典含氮自由基，分析对DPPH·的消除能力可判断儿茶素的抗氧化性强弱。不同质量分数的儿茶素对DPPH·的清除率见图5。

图5 不同质量分数的儿茶素对DPPH·的清除率

由图5可知，加入儿茶素后复合膜对DPPH·的清除率显著提高，其中Q5对DPPH·的清除率最大为77.78%，空白试样Q1的消除率只有42.26%，当加入0.2%的儿茶素后，复合膜对DPPH·的清除率提高到75.6%。在被测浓度范围内，当儿茶素的含量进一步增加时，复合膜的消除效果较为稳定。儿茶素/CS复合膜对DPPH·清除能力的强弱为Q5>Q3>Q4>Q2>Q1。这表明儿茶素的加入能有助于复合膜抵抗自由基引起的氧化作用，加入的儿茶素质量分数为0.8%时，儿茶素/CS复合膜对DPPH·的清除效果最好。

2.5.2 清除·OH的能力

·OH是含氧自由基中氧化活性最强的一种，因此检测儿茶素/CS复合膜对清除·OH的能力是评价复合膜抗氧化性强弱的重要指标。不同质量分数的儿茶素对·OH的清除率见图6。

图6 不同质量分数的儿茶素对·OH的清除率

由图6可知，随着儿茶素的加入，复合膜对·OH的清除率先增加然后减小，复合膜对·OH清除率的大小顺序为Q3>Q2>Q1>Q5>Q4，样品Q3清除效果最好，为77.09%，即儿茶素的质量分数为0.4%时，对·OH的清除效果最好。在Q3之后，但随着儿茶素的量进一步增加，清除率迅速下降。这表明低浓度的儿茶素对·OH有显著的清除作用，一旦儿茶素的量过多，其对·OH的清除效果就会显著下降。