倪 婕，李 菲，李雨霖，陆 璐，3，谢一嘉，刘小玲，余 炼*

(1.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.广西科学院/广西近海海洋环境科学重点实验室，广西 南宁 530007；3.广西科学院广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室培育基地，广西 南宁 530007)

【研究意义】红树林(Mangrove)分布于热带和亚热带地区，是一种处于海洋和陆地过渡带的特殊生态系统，包括红树植物、细菌、真菌、微藻、鸟类、无脊椎动物和哺乳动物等类群[1]。该生境的红树植物频繁遭受潮汐淹没和强紫外线照射，致使其根部处于间歇性缺氧状态[2]。其中，内生菌作为红树植物的重要组成部分，其种类丰富且数量庞大，在长期抵抗海洋高温、高盐、强风、缺氧和强紫外线等恶劣条件的过程中，其遗传物质得到不断适应和进化[3]，因而相比于陆生来源的微生物，其产生的代谢产物结构特殊、抗菌作用机制新颖，是新型海洋药用先导化合物的重要来源[4]。白骨壤(Avicenniamarina)又名海榄雌，为马鞭草科灌木或小乔木，具有细棒状的出水呼吸根，是红树林的优势树种；叶片近无柄，革质，呈黄绿色；果实为浑圆心形，俗称“榄钱”[5]，具有根系发达、生长快速、对恶劣环境适应性强等特点，富含可产生抗生素、防腐剂和酶等活性物质的内生菌[6]。白骨壤作为药用植物资源，可用于治疗疟疾、风湿、哮喘、天花和溃疡等多种疾病[7]，药理学实验显示，其所含的二萜类、环烯醚萜和萘醌类等化合物具有改善癌症、糖尿病、炎症、腹泻及氧化应激等疾病的药物特性[8]。白骨壤的内生细菌与植物体互利共生，能产生与宿主相同的信号传导通路，合成与宿主类似的活性次生产物，这些产物具有抑制植物病原菌[9]、抗衰老[10]及杀虫[11]等功效。然而，目前鲜见对白骨壤各部位内生细菌进行系统分离鉴定的报道，其抑菌活性方面的用途也未得到充分发掘。因此，勘探白骨壤内生细菌的多样性及其生物学活性，对促进红树林微生物资源的开发和应用具有重要意义。【前人研究进展】靳鹏飞等[12]首次从白骨壤中分离到32株丝状内生真菌，其中有6株能显著抑制金黄色葡萄球菌。陈振明等[9]从白骨壤中获得13株内生细菌，其中9株对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用。Viswanath等[13]从白骨壤根际分离到约800株细菌，其中55 %能分泌群体感应信号分子AHL进行群体交流和协调。Ali等[14]从白骨壤中分离出28株内生细菌，其中有2株能显著提高植物的盐碱耐受性。Jiang等[15]对白骨壤各部位进行放线菌分离筛选，共得到10株至少对1种ESKAPE病原体具有抑制作用的放线菌。李蜜等[11]从白骨壤中分离到14株内生细菌，其中的Stenotrophomonasrhizophila具有延缓线虫衰老能力。可见，红树植物白骨壤的内生菌具有丰富且独特的物种多样性，对研究和应用其活性化合物资源意义重大。目前，将16S rRNA基因序列分析用于细菌分类和鉴定的研究越来越多，如：李飞娜等[16]从桐花树、老鼠簕和秋茄等12种植物中共获得192株内生放线菌，经16S rRNA基因序列分析，其潜在新种共有22株，放线菌资源新颖性高；江蕾等[17]对分离自海黄瓜的34株共附生细菌进行16S rRNA基因序列鉴定，结果发现这些细菌隶属于18科24属；李小群等[18]从海芒果及其根际土壤中共分离得到15株可培养细菌，经16S rRNA基因序列分析，发现其分属于厚壁菌门和放线菌门的发育类群。可见，16S rRNA基因序列分析已成为微生物多样性研究的重要工具。【本研究切入点】广西北仑河的白骨壤内生细菌具有产生丰富活性代谢物质的潜能，但目前针对该海域白骨壤各部位内生细菌多样性及其抑菌活性的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】结合16S rRNA基因序列分析系统地研究白骨壤各部位可培养内生细菌的多样性，并分析这些内生细菌次生代谢产物的抑菌活性，为充分利用红树植物内生细菌资源和开发安全、高效的海洋药物前体化合物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 白骨壤样品 优势树种白骨壤的根、皮、叶、花和果实样品采集于广西北部湾北仑河口红树林保护区(东经108°16′30″，北纬21°35′00″)，置于无菌封口袋4 ℃保存。

1.1.2 培养基 参考李小群等[18]、李菲等[19]的方法采用AGG、M4、M5、M7、M9、M10、M11、ISP2、ISP3、ISP7和PDA等11种分离培养基对白骨壤内生细菌进行分离，其中发酵培养基为ISP2液体培养基。

1.1.3 菌株 指示菌啤酒酵母菌(SaccharomycescerevisiaeCICC 33032)、黑曲霉(AspergillusnigerCICC 2487)、扩展青霉(PenicilliumexpansumCICC 40658)、枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCICC 20612)和埃希氏大肠杆菌(EscherichiacoliCICC 23657)由广西大学轻工与食品工程学院微生物实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离纯化及保藏 将完整无病害的白骨壤果实、花和叶等组织依次浸泡于0.5 %次氯酸钠溶液和消毒酒精中灭菌各3 min，最后用无菌水冲洗3次，取1.0 g样品与1.0 mL无菌水混合，经组织研磨器研磨后，采用梯度稀释法处理匀浆，各取0.2 mL 10-2和10-3稀释度的样液用涂布棒涂布均匀，多数菌落在28 ℃条件下培养3～5 d长出，此时可进行计数和分离。纯化后的菌株以20 %(W/V)甘油为保藏剂，置于-80 ℃长期冻存。

1.2.2 16S rRNA基因序列鉴定 以27F和1492R为引物，采用Chelex-100法[20]提取白骨壤内生菌株的总DNA作为PCR模板，PCR反应体系和条件参考李菲等[1]的方法。通过琼脂糖凝胶电泳验证目标条带后，委托北京擎科新业生物技术有限公司对扩增成功的PCR产物进行测序。采用BioEdit软件对测序结果进行编辑整理后，将序列导入数据库EzBioCloud(https://www. ezbiocloud. net/)在线比对和进行Clustal X多重比较。选择与测序菌株同源性最高的菌种序列，利用MEGA 5.0和邻位归并法进行聚类分析，构建系统发育进化树以推断进化关系[21]。

1.2.3 菌株发酵及次级代谢产物提取 采用装有200 mL液体培养基的500 mL锥形瓶制备发酵液，灭菌后接入1环对数生长期的菌体，在180 r/min、30 ℃恒温摇床中培养7 d等待代谢产物充分产生。经冷冻离心后弃菌体，用1∶1(V/V)乙酸乙酯充分萃取，于43 ℃的旋转蒸发器中减压浓缩。依次用少量乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇和石油醚将次级代谢产物溶出，利用通风橱挥发至干，最后用2.0 mL DMSO溶液溶解备用。

1.2.4 菌株抑菌活性试验 采用牛津杯法[22]测定分离菌株对1.1.3中5种指示菌的抑菌活性。将检测菌浓度调至105～106CFU/mL制备检测平板。每个牛津杯添加80.0 μl内生细菌的次级代谢产物，以DMSO溶液为空白对照，在28 ℃下培养，待指示菌长出覆盖平板后测量抑菌圈直径。参考覃媚等[23]的标准判断抑菌活性的强(抑菌圈直径≥20 mm)、中等(抑菌圈直径10～20 mm)和弱(抑菌圈直径6～10 mm)。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的多样性分析结果

根据菌落的颜色、形态、大小及生长时间等特征，在白骨壤的果实、根、皮、叶和花5个部位中共分离出61株细菌，隶属于3门4纲12目16科20属36种，其中，α-变形菌纲和γ-变形菌纲各8株，各占总菌株数的22.22 %；芽孢杆菌门8株，占总菌株数的22.22 %；放线菌门12株，占总菌株数的33.33 %，其中放线菌包括8个属，分别为链霉菌属、微单孢菌属、角杆菌属、假动球菌属、棒状杆菌属、Sinomonassp.、微杆菌属和戈登氏菌属(表1)。说明放线菌是白骨壤内生细菌的优势类群。

表1 白骨壤内生细菌的组成

根据鉴定出的36株内生细菌16S rRNA基因序列，选择与其最相似的参比菌株构建N-J系统发育进化树。从图1可看出，菌株YA080与肠杆菌科的有效发表菌株PantoeaanthophilaLMG 2558T的相似率最低，为94.59 %；YA348与橙单胞菌科的有效发表菌株AurantimonascoralicidaDSM 14790T的相似率次之，为94.97 %。此外，菌株YA130与ThioclavapacificaDSM 10166T、YA204与SphingomonasaquatilisJSS7T、YA217与CorynebacteriumvariabileDSM 20132T、YA252与CorynebacteriumterpenotabidumDSM 20132T、YA265与SinomonassoliCW 59T及YA274与GordoniaterraeNBRC 100016T的相似度分别为95.93 %、96.05 %、96.95 %、97.01 %、97.90 %和96.47 %。以上8株菌株与模式菌的相似度低于98.65 %[24]，与各自所在菌科中序列相似的菌株在N-J系统发育进化树上聚类为一簇。可见，该8株菌株是其所在菌科中潜在的新分类单元，本研究中白骨壤的内生细菌潜在新种率为22.22 %，且多为放线菌门，包括棒状杆菌属、Sinomonassp.和戈登氏菌属。

图1 白骨壤内生细菌的N-J系统发育进化树Fig.1 Neighbor-Joining tree of endophytic bacteria in A. marina

2.2 内生细菌在各分离培养基及各组织部位的分布情况

从属的水平对白骨壤花、果实、根、叶和皮的内生细菌进行韦恩图(图2)分析，结果从各组织部位中均分离到Bacillussp.菌株，从花、皮和根中均分离到Pseudomonassp.菌株，从花和果实中均分离到Stakelamasp.和Acinetobactersp.菌株，从花和皮中均分离到Pantoeasp.和Mangrovibactersp.菌株，从果实和皮中均分离到Stakelamasp.菌株，从花和叶中均分离到Corynebacteriumsp.菌株。从图2还可看出，从白骨壤各组织分离到的内生细菌种属数量排序为果实>花>皮>根=叶，在果实部位的内生细菌属最多，共10个属，占总属数的50.00 %，花次之，有9个属，其后皮有7个属，叶和根各有2个属。说明在白骨壤的不同组织中，其内生细菌的数量及种属存在差异。

从图3可看出，从不同培养基分离得到的种属数与菌株数呈正比，获得细菌数量较多的培养基其种属数也较丰富。其中，AGG(改良高氏培养基)中内生细菌的多样性最丰富，共分离到8个菌属，可作为分离培养基；从M11(棉子糖-组氨酸培养基)中分离到的菌株最少，仅1株。说明由不同培养基分离得到的白骨壤内生细菌种属数量有所不同。

2.3 白骨壤内生细菌的抑菌活性分析结果

由表2可知，36株细菌均至少对1种病原菌具有抑制能力，其中，芽孢杆菌属菌株YA001和YA304、鞘氨醇单胞菌属YA257、假单胞菌属YA265对5种病原菌具有抑菌活性；共有25株细菌对大肠杆菌具有抑菌活性，占总菌株数的69.44 %，尤其以YA350、YA304和YA124的次级代谢产物对大肠杆菌的抑制能力更强；枯草芽孢杆菌的活性菌株有28株，占总菌株数的77.78 %，尤其以YA350对枯草芽孢杆菌的抑制效果最佳；啤酒酵母的活性菌株有29株，占总菌株数的80.56 %；有26株细菌对扩展青霉菌有抑制活性，占总菌株数的72.22 %，尤其以YA350的抑菌圈直径达30.2 mm，在所有菌株中抑菌活性最明显；有19株细菌对黑曲霉菌具有抑菌活性，占总菌株数的52.78 %，且从白骨壤中获得的芽孢杆菌对黑曲霉均有抑制效果。说明白骨壤的部分内生细菌对病原真菌和细菌具有较强的抑菌活性。

图2 白骨壤各组织中内生细菌属级群类分布韦恩图Fig.2 Venny of endophytic bacteria genera in A. marina

3 讨 论

我国于2000年建立了广西北部湾北仑河口国家级自然保护区，该区域拥有河口和海域等多种类型的海岸地貌，平均气温、降水量和土壤盐分均适宜各物种生长繁殖，在遗传结构、物种组成和生态系统稳定性等方面具有其他海区无法比拟的优势，也因此蕴育了丰富的生物多样性[25]。本研究从该地区的红树植物白骨壤组织中共分离到36株细菌，隶属于3门4纲12目16科20属36种，其中，属于放线菌的有8个属12株，是最优势类群，与Genilloud[26]研究指出产生生物活性物质的菌株中有约45 %是放线菌的观点相似，说明白骨壤中的内生放线菌资源丰富，产生生物活性物质的潜力巨大。在新颖性方面，本研究从北仑河口的红树植物白骨壤中共得到8株潜在新种，且多来自放线菌门，均匀分布于果实、花、叶和皮中，新种率为22.22 %，高于李菲等[1]从无瓣海桑中获得菌株的潜在新种率(13.2 %)和李家怡等[27]从红海榄中分离所得菌株的潜在新种率(17.6 %)，可能与白骨壤新陈代谢较快及耐盐和耐淹水能力较强[28]有关，说明宿主对环境的高适应能力更有利于孕育丰富的物种。

图3 不同培养基分离得到的白骨壤内生细菌数对比Fig.3 Endophytic bacteria numbers of A. marina isolated from different media

表2 36株白骨壤内生细菌对5种指示菌的抑菌活性

本研究结果表明，从白骨壤的果实、花、根、皮和叶组织中均分离到Bacillussp.菌株，与Divya等[29]研究认为芽孢杆菌具有易于生长及能适应各种环境等特点的观点一致；从白骨壤分离得到的内生细菌在果实和花中分布居多，在根和叶中占少数，与李蜜等[10]、李菲等[1]、李家怡等[27]的研究结果存在较大差异，表明内生菌的多样性与宿主植物所处的季节、地理方位和生存环境等有关[30]，也表明内生菌会随着植株的生长发育将种子及根际中的内生菌垂直转移到花和果实中[31]。本研究的采样时间在8月，此时正值白骨壤的盛果期，果实内部的微生物得到充足的营养物质从而大量生长繁殖，可能是果实和花中的内生菌数量多于根、皮等部位的原因之一。此外，成熟期时果实的水分逐步流失、淀粉大量积累，使得该部位产生的内生菌通常能耐受高渗透压，具有淀粉酶活性[32]；在11种分离培养基中，AGG培养基最具优势，共分离到8个菌属且多为放线菌，可作为分离内生细菌的首选培养基，与李菲等[19]的研究结论一致。

在本研究的抑菌试验中，36株细菌均至少对1种指示菌株具有抑制活性，其中有4株菌表现出广谱抑菌活性，说明从白骨壤内生细菌中分离出活性突出的次级代谢产物潜力巨大。其中，YA304和YA350的抑菌能力最突出，二者分别与BacillussiamensisKCTC13613T和MicromonosporawenchangensisCCTCCAA2012002T的相似性最高。Jeong等[33]发现暹罗芽孢杆菌KCTC13613T能显著抑制植物病原真菌立枯丝核菌和灰葡萄孢菌，且对革兰氏阳性菌黄体微球菌也有较强的抗菌活性。本研究分离到的暹罗芽孢杆菌YA304对大肠杆菌具有强抑制效果，对啤酒酵母、扩展青霉菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉则有中等抑菌效果，进一步丰富了对Bacillussiamensis菌株抑菌活性的认识；文昌小单胞菌YA350对扩展青霉的抑菌圈直径达30.2 mm，活性最高，具有开发为天然杀菌剂和成为水果采后青霉病生防菌株的巨大潜力。Takahashi和Omura[34]研究指出，新物种中出现新型活性化合物的潜力相对较大，本研究8株潜在新种均至少对3种指示菌表现出抑制效果，与Takahashi和Omura[34]的研究结果吻合。

4 结 论

从白骨壤的果实、花、皮、根和叶部位分离得到的内生细菌多样性较丰富，潜在新种率较高，且部分菌株具有广谱抑菌活性，可作为开发新型生物活性化合物的重要来源。