伏成秀，李铭刚，吴 翔，付 斌，张 庆，施竹凤，倪 明，胡万里，杨明英，朱红业，杨佩文*

(1. 云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2. 云南大学，云南 昆明 650091；3. 四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)

【研究意义】洱海北部地区农田每年因淋溶而流入湖泊的氮磷是导致水体富营养化的主要污染源[1]。寻求控源减排兼顾产量、经济效益和环境效益的适宜水肥管理模式是提高土壤生产力，防治土壤氮磷素流失和保护水质的重要研究内容[2]。【前人研究进展】相关研究指出，通过合理施肥，平衡农田土壤养分，使输入与输出趋于平衡，减少养分累积与流失，是综合治理农业面源污染的主要技术措施[3]。国内外很多室内模拟试验、田间长期定位试验和区域调查监测等碳氮耦合关系研究结果表明，合理施肥能够保持或提高土壤碳氮含量，有机碳在一定程度上有利于氮积累，而氮输入可减少有机碳矿化而促进碳累积，二者间存在耦合关系[4]。雷宝坤等研究结果表明，土壤“碳汇”可以增强“氮汇”的功能，从而阻止土壤氮素的流失，实现碳素控制农田氮素流失的面源污染[5]。张丹等在洱海流域水稻-油菜轮作农田设置长期定位试验，基于秸秆还田对土壤微生物熵和微生物量碳/氮变化动态的影响，初步探讨了有机碳源物料输入降低土壤氮素流失的影响机制，结果表明，有机碳源物料输入增强了土壤微生物氮素固持能力而有效降低了土壤氮素流失的风险，但系统深入的微生物过程有待进一步研究[6]。【本研究切入点】洱海流域地区是多元少数民族文化汇集地区，特殊的地形-气候-水文特征及人类活动等的耦合，形成了该区域土壤富含有机质，碳氮库明显高于其它地域土壤的特点，但目前对其碳氮共济效应关键的土壤微生物过程缺乏深入系统的研究，制约了对区域农田优化管理的准确性和全面性[7]。【拟解决的关键问题】本研究基于油菜-水稻轮作种植模式下有机碳源输入定位试验，运用微生物核糖体RNA基因靶向测序技术和qPCR技术，分析土壤细菌种群结构组成、丰度以及碳氮转化功能基因丰度的差异，解析其变化特征；结合Perason相关性分析，解析细菌多样性和种群结构对有机碳源物料输入的响应特征。

1 材料与方法

1.1 试验地概况和试验设计

持续开展陈安强等的定位试验[8]，试验田位于洱海流域洱源县凤羽镇(99°57′E，25°58′N)，海拔2099 m，年平均气温13.90 ℃，年降水量745.00 mm，土壤类型为水稻土，典型的北亚热带高原季风气候，水稻-油菜水旱轮作种植模式，油菜种植时间为当年的11月，收获时间为次年5月，水稻种植时间为当年6月，收获时间为10月。本研究选取其中5个处理为研究对象，即处理1(CK)，不施用有机肥和氮磷钾化肥；处理2，不施用有机肥，单施用氮磷钾化肥；处理3，玉米秸秆+化肥；处理4，蚕豆秸秆+化肥；处理5，松针+化肥。各处理的重复设置、面积、施肥(品种、用量、时期等)和有机碳源物料(品种、用量、时期等)等试验内容与陈安强等的设置相同[8]。

1.2 土壤样品采集、处理

2019年于油菜和水稻收获期按照常规取样法分别取0～20 cm土层土样，每个小区对角线5点取样，然后混合均匀为1个样，挑除根系等杂质后，一部分土样过1 mm 筛后迅速放入做好标记的自封袋中，置于低温保温箱中，带回实验室后分成2份，一份于-80 ℃冰柜中预冷冻1 h后再进行冷冻干燥，待充分干燥后置于-80 ℃冰柜妥善保藏，以备后续DNA提取用。另一份进行自然风干，待充分干燥后置于室温妥善保藏，用于后续理化性质分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤养分指标测定 土壤全氮(TN)含量采用凯氏定氮法测定，有机质(OM)含量采用重铬酸钾外加热法测定，土壤pH采用pH 仪进行测定[9]。

1.3.2 土壤DNA 提取、细菌16S rRNA基因的高通量测序 土壤微生物总DNA用OMEGA 土壤总DNA提取试剂盒按操作说明书进行提取，DNA提取质量通过0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测，DNA定量采用紫外分光光度计定量。合格DNA 送至上海派森诺生物股份有限公司进行高通过测序。分别对细菌16S rRNA的单V区(V4)和真菌ITS1区进行PCR扩增，细菌16Sr RNA V4区PCR扩增引物为520F(5′AYTGGGYDTAAAGN3′)和802R(5′TACNVGGGTATCTAATCC3′)。以扩增产物为模板进行Illumina MiSeq测序文库制备，并进行Illumina MiSeq系统测序。

1.3.3 土壤微生物高通量测序数据统计分析 测序原始数据经疑问序列识别、检查并剔除嵌合体序列，获得样本的有效序列[10]。以每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列，基于97 %的序列相似度进行OTU归并和划分，构建各样本中OTU丰度矩阵。根据OTU丰度矩阵结果，计算每个样本中共有的OTU数量；以Chao1丰富度指数和ACE指数评价微生物群落丰富度；以Shannon多样性指数和Simpson多样性指数评价微生物群落的均匀度。利用每个OTU的代表序列，进行对应数据库的模板序列比对，细菌16S rRNA基因模板序列基因库选用Greengenes数据库(Release 13.8，http://greengenes. secondgenome.com/)[11]。通过OTU分类地位鉴定，获得每个OTU所对应的分类学信息，统计每个样本在各分类水平组成。

1.3.4 土壤碳氮转化功能微生物qPCR定量检测分析 土壤DNA 提取方法、质量和浓度及纯度检测同上。选取碳固定cbbL-R基因、氮固定的nifH基因和硝化作用的amoA、amoB基因为标记基因，各功能基因扩增所用引物序列及定量PCR扩增程序参照顾卿等[12]。以土壤DNA为模板，进行各个功能基因的PCR扩增，随后进行目的片段回收纯化、质粒转化(pMD18-T-158)、计算质粒浓度和拷贝数，建立标准曲线。通过PCR扩增获得检测样品的Ct 值，并计算特异性基因片段拷贝数。具体操作方法参照Walker等反应体系及方法[13]。

1.4 数据统计分析

测试数据经Microsoft Excel软件整理；用DPS 7.05 Duncan多重比较法检验处理间差异性；用SPSS 18.0 的Perason双变量相关分析法分析不同因子间相关性。

2 结果与分析

2.1 土壤碳、氮素含量及pH

如图1所示，化肥处理的土壤有机质、碳氮比和pH等3个理化指标均低于处理1(CK)，全氮含量则高于处理1(CK)，差异性显著(P<0.05)；而有机碳源物料配施化肥各处理的土壤有机质含量、全氮含量和碳氮比等3个指标数值则均有显著提升，差异性显著(P<0.05)。与油菜种植季相比，水稻种植季后土壤的有机质含量、全氮含量和碳氮比等3个指标数值均呈降低趋势。

图2 土壤样本细菌Clean tags、OTUs丰度及α多样性指数Fig.2 Soil clean tags, OTUs abundance and diversity index of each soil samples

2.2 土壤细菌种群多样性

如图2所示，各处理的细菌Clean tags和OTUs差异性不显著(P≥5)；丰富度指数Chao1和ACE以及均匀度指数Shannon和Simpson等4个多样性指数差异性均不显著(P≥5)；在不同的种植季，土壤细菌Clean tags数、OTUs丰度及α多样性指数等的差异性均不显著(P≥5)。

2.3 土壤细菌种群组成

如表1所示，根据物种注释结果，在细菌门的分类水平上检测到的前5个优势细菌种群，其相对丰度从大到小依次为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，5个优势细菌种群占总原核微生物群落丰度的91 %以上。在不同的种植季，细菌门分类上的种群结构组成相似，平均相对丰度所占比例略有差异，但差异性未达显著水平(P≥5)，两季呈相似变化趋势。

2.4 土壤环境因子与细菌种群间的相关分析

如表2所示，细菌种群中的Proteobacteria和Acidobacteria种群相对丰度与土壤有机质含量和全氮含量呈显著负相关关系(P<0.05)，Chloroflexi和Actinobacteria种群相对丰度与土壤有机质含量和全氮含量间则呈显著正相关关系(P<0.05)。不同种植季土壤碳氮素与细菌种群相对丰度的关系呈相似趋势。

2.5 土壤碳氮功能基因qPCR定量检测统计结果

以单位土壤质量DNA提取基因的拷贝数表征基因丰度，如表3所示，cbbL-R基因拷贝数各处理间差异性不显著(P≥5)。处理1(CK)与处理2间nifH拷贝数差异性不显著(P≥5)，而有机碳源物料配施化肥各处理的基因拷贝数则显著增加(P<0.05)。单施化肥处理和有机碳源物料配施化肥处理均能显著提高amoB的拷贝数；所有处理间amoA拷贝数差异性则不显著(P≥5)。碳氮转化功能基因拷贝数呈amoB>nifH>amoA>cbbL-R的趋势，相对于nifH拷贝数和amoA拷贝数，cbbL-R拷贝数少一个数量级；相对于nifH拷贝数和amoA拷贝数，amoB的拷贝数则高一个数量级。水稻种植季后各处理nifH拷贝数明显增加，其它基因拷贝数与油菜种植季呈相似变化趋势。

表4 土壤碳氮功能微生物种群与土壤环境因子相关性的Pearson分析

如表4所示，Perason分析结果表明，nifH拷贝数与土壤有机质含量和全氮含量间呈极显著正相关关系(P<0.01)；其它功能基因拷贝数与土壤环境因子间呈正相关关系或负相关关系，但差异未达显著性水平(P≥5)。油菜-水稻种植季土壤碳氮素对碳氮转化功能基因拷贝数的影响呈相似趋势。

3 讨 论

3.1 油菜-水稻轮作模式下土壤细菌种群变化特征

从试验区土壤碳、氮素变化情况来看，在油菜-水稻轮作种植式下，单施化肥降低土壤有机质和碳/氮比，而有机碳源物料配施化肥均提高土壤有机质和碳/氮比，与油菜种植季相比，水稻种植季后土壤有机质、全氮和碳/氮比均呈下降趋势，这可能是水稻种植季部分碳氮素溶于水而淋失有关。但从总体趋势来看，土壤碳/氮比与有机质和全氮间呈显著正相关关系，说明可以通过增加土壤有机质含量提高土壤氮固存，从而减少氮流失的策略的可行性。从土壤细菌种群结构组成变化特征分析结果看，油菜-水稻水旱轮作模式和不同施肥处理未对其产生显著影响，可能与其土壤较高的碳氮素含量有关。相关研究也表明，土壤中碳氮素的有效性是决定土壤微生物多样性和功能多样性的重要因素，微生物群落能够通过调节自身的养分利用效率而适应资源的不平衡[14-15]。仇存璞等在研究2种典型水稻土秸秆碳转化的微生物过程发现，稻田土壤有机质的含量和成份组成是影响微生物生物量和群落组成的核心因素，外源有机碳源物料添加主要导致了有机质降解功能微生物种群结构的变化，但土壤原有的有机质含量和成份组成是导致这种变化的重要因素[16]。

3.2 油菜-水稻轮作模式下土壤碳氮转化功能基因丰度变化特征

微生物是土壤碳氮素转化关键过程的驱动者与调节者，微生物通过酶的催化作用介导代谢过程，而酶活性受相应功能基因调控。其中，碳固定cbbL-R基因，甲烷代谢mcrA基因，纤维素降解CBH基因，氮固定的nifH基因，硝化作用的amoA基因，反硝化作用的nirK和nirS基因等均广泛应用于环境微生物生态学研究，基因拷贝数可以指示碳氮转化功能微生物的丰度[17]。本研究结果表明，各处理间固碳基因cbbL-R丰度差异性不显著，化肥施用或有机碳源物料配施化肥对基因丰度的影响均不显著，可能与试验区土壤本底较高碳氮素含量有关。单施化肥处理显著提高amoB基因丰度，而对amoA基因丰度影响不显著，表明在该试验区域土壤TN含量对amoB基因丰度的影响大于amoA基因丰度。相关研究也表明[18]，参与氮硝化作用的氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOB)具有完全不同的生态位，土壤氮素含量是决定其丰度的重要因素，高氮土壤环境是AOB驱动氮硝化作用的功能微生物，而低氮土壤环境是AOA驱动氮硝化作用的功能微生物，土壤环境条件主导AOB和AOA的生理生态功能，进而对硝化作用过程产生影响。有机物料配施化肥显著提高nifH基因和amoB基因丰度，表明化肥施用以及有机物料通过矿化和降解释放氮补充土壤氮库，促进了固氮细菌的生长繁殖，显著提高固氮微生物种群的丰度；同时避免了固氮微生物与作物竞争氮素，促进作物生长，提高土壤自身固氮能力，与刘骁蒨等的试验结果相同[19]。从不同种植季碳氮功能基因丰度变化来看，水旱轮作种植模式对固碳基因cbbL-R和硝化作用amoA、amoB基因的丰度影响不显著，但水稻种植季显著提高了氮固定的nifH基因的丰度，水稻种植促进了固氮微生物种群丰度和活性，对固碳功能微生物种群和氮硝化功能微生物种群丰度和活性的影响较小。研究结果中碳氮转化功能基因丰度的变化情况直接反映了较高碳氮素含量土壤背景下，碳氮转化功能微生物种群丰度对油菜和水稻轮作种植模式对的响应情况。

4 结 论

在洱海流域油菜-水稻水旱轮作农田，土壤有机质(OM)和全氮(TN)与细菌种群中的变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的种群相对丰度呈显著负相关关系，与绿弯菌门(Chloroflexi)和放线菌门(Actinobacteria)的种群相对丰度呈显著正相关关系；其中，土壤OM对微生物种群丰度的影响解释度最高。在油菜和水稻种植季，不同处理间Clean tags数量、OTUs丰度及α多样性指数差异性不显著(P≥5)，门分类水平上的优势细菌种群相对丰度差异性不显著(P≥5)。

处理间固碳基因cbbL-R和氨氧化基因amoA的拷贝数差异性不显著(P≥5)，有机碳源物料配施化肥显著提高固氮基因nifH和氨氧化基因amoA拷贝数(P<0.05)；土壤全氮(TN)对土壤碳氮转化功能基因拷贝数影响的解释度最高。在油菜和水稻种植季，油菜和水稻种植季土壤碳氮转化功能基因丰度呈相似变化趋势。

在洱海流域油菜-水稻水旱轮作农田，水旱轮作对土壤细菌种群多样性的影响不显著(P≥5)，其群落结构组成和多样性稳定性可能与土壤本底较高的碳氮素含量有关。