钱润梅 彭发全 陈萍

结直肠癌是临床上较常见的胃肠道恶性肿瘤，发病率呈上升趋势，严重威胁人类健康[1]。尽管近年来结直肠癌诊断和治疗技术取得很大进展，但病死率仍然很高[2]。因此，寻找新的结直肠癌诊断标志物，开发新的治疗靶点迫在眉睫。近年来研究发现遗传改变和表观遗传修饰在癌症的发生、发展过程中发挥重要作用，但与结直肠癌有关的研究较少[3]。ARM重复X连锁蛋白2（ARM proteins lost in epithelial cancers X chromosome 2，ARMCX2）是ARMCX家族重要成员，在细胞恶性转变过程中发挥重要作用[4]。基底层上皮细胞中ARMCX2表达上调，是促进细胞增殖的重要基因[5]。但ARMCX2在结直肠癌中的表达研究较少。本研究通过检测结直肠癌中ARMCX2的阳性表达，分析其与临床病理特征的关系以及与K-ras基因突变的相关性，为结直肠癌临床诊断提供新的标志物。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2012年1月至2014年8月在浙江中医药大学附属第二医院确诊为结直肠癌的患者87例，术后病理检查结果均为结直肠腺癌。其中男46例，女41 例；年龄 34～88（59.5±11.5）岁，＜60 岁 47 例，≥60岁40例；高分化20例，中分化45例，低分化22例；肿瘤最大径＜5 cm 42例，≥5 cm 45例；浸润深度未侵出肌层37例，侵出肌层50例；有淋巴结转移23例，无淋巴结转移64例；有血管淋巴管侵犯67例，无血管淋巴管侵犯20例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期25例，Ⅲ期40例，Ⅳ期11例。纳入标准：（1）依据WHO中结直肠癌的病理诊断标准[6]，并由病理医师复核切片；（2）首次确诊并进行手术治疗；（3）临床及病理资料齐全。排除标准：（1）患有 Lynch 综合征者；（2）术前进行放、化疗者；（3）有异源性分化者；（4）有肠道手术史者。并留取距结直肠癌组织边缘＞3 cm的正常结肠黏膜组织（癌旁组织）87例作为对照。本研究经医院伦理委员会审查通过，符合《赫尔辛基宣言》中的相关要求，家属均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）（ZM-0010）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（SC-7480）和 GAPDH（TA309157）购自北京中杉金桥生物技术公司；qRTPCR试剂盒购自苏州睿赢生物技术有限公司；引物由苏州睿赢生物技术有限公司合成；ARMCX2（P-14）浓缩液购自美国Santa Cruz公司；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（RLM3031） 浓缩液购自苏州睿赢生物技术有限公司；人K-ras基因7种突变检测试剂盒（HWTS-113）购自江苏宏微特斯医药科技有限公司。

1.3 结直肠癌组织和癌旁组织中ARMCX2表达及结直肠癌组织中PCNA表达检测 采用免疫组化法。结直肠癌组织和癌旁组织石蜡包埋，切取4 μm厚切片，80%甲醇孵育10 min阻断内源过氧化物酶活性；PBS清洗，0.1 mmol/L枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复；PBS清洗，滴加 50 μl一抗（ARMCX2稀释浓度为 1:350，PCNA 稀释浓度为 1:200）37 ℃孵育1 h。PBS清洗，滴加 50 μl辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育1 h；PBS清洗，滴加链霉亲和素-过氧化物酶37℃孵育1 h。PBS清洗，DAB显色复染后封片，显微镜下观察：ARMCX2表达的部位是细胞质和（或）细胞膜，PCNA表达的部位是细胞核，以棕褐色判断为阳性。根据3个高倍镜视野中阳性细胞所占比例进行评分。

1.4 结直肠癌组织和癌旁组织中Bax和Bcl-2蛋白表达水平检测 采用Western blot法。结直肠癌组织和癌旁组织研磨后，12 000 g/min 4℃离心15 min，将上清液转移到1.5 ml离心管中分装，测定蛋白浓度。取20 μl蛋白质溶液，加入样本至孔中，电泳，取出凝胶，并根据蛋白Marker所指示的位置，将目的蛋白所在的条带剪下，取出PVDF膜进行免疫杂交，取出膜后加入超敏发光液，发光时间2 min。将膜取出放入X线胶片盒曝光3 min，显影20 s。将各条带用Image J软件进行灰度扫描并以GAPDH为内参校正。

1.5 结直肠癌组织中K-ras基因突变检测 参考潘理会等[7]方法，大致过程如下：使用组织DNA提取试剂盒从之前制作好的肿瘤组织标本中提取所需DNA样本。琼脂糖凝胶鉴定提取出的DNA纯度。K-ras基因突变检测试剂盒对所提取的 DNA标本进行 K-ras基因第二外显子第12、13密码子基因突变分析。反应体系：95℃8 min，循环 1 次；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，循环15次；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，循环 31次。K-ras基因发生突变主要是1号外显子中第12、13号密码组发生变异。K-ras上游引物：5′-AAATCTGGGCAGGCTG-3′，下游引物：5′-CAACTTACTGGGTACGCTT-3′；G 和 A 简并引物：5′-TTGTGGTAGTTGGAGCT-3′。在60℃时收集信号，用CXF96软件分析K-ras基因状态。判断标准：以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值。没出现扩增曲线或Ct值为0的标本为无K-ras突变；出现扩增曲线且Ct≤26.0的标本为K-ras突变；出现扩增曲线且26.0＜Ct≤28.0的标本为K-ras突变假阳性，需再次检测。

1.6 术后随访情况 患者术后随访5年，截止至2019年8月15日。

1.7 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验。结直肠癌组织中ARMCX2与PCNA、Bax、Bcl-2的相关性分析采用Pearson相关。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁组织中ARMCX2的表达及结直肠癌组织中PCNA的表达 结直肠癌组织中ARMCX2阳性表达率为51.7%（45/87），高于癌旁组织的10.3%（9/87），差异有统计学意义（χ2=34.800，P＜0.01），见图1。结直肠癌组织中PCNA阳性表达率为43.7%（38/87），见图 2。

图1 结直肠癌组织和癌旁组织中ARM重复X连锁蛋白2（ARMCX2）的表达（a：ARMCX2在癌旁组织中阴性表达，未见着色；免疫组化，×200；b：ARMCX2在结直肠癌组织中阳性表达，表达部位是细胞质和细胞膜；免疫组化，×400）

图2 结直肠癌组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，阳性细胞表达部位是细胞核（免疫组化，×200）

2.2 结直肠癌组织中ARMCX2阳性表达与临床病理特征的关系 结直肠癌组织中ARMCX2阳性表达与肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移、血管淋巴管侵犯和TNM分期均有关（均P＜0.05），而与性别、年龄和分化程度均无关（均P＞0.05），见表1。

表1 结直肠癌组织中ARMCX2阳性表达与临床病理特征的关系[例（%）]

2.3 结直肠癌组织和癌旁组织中Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较 与癌旁组织相比，结直肠癌组织中Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 2、图 3。

2.4 结直肠癌组织中ARMCX2与PCNA、BAX、Bcl-2的相关性分析 Pearson相关分析显示ARMCX2与BAX 的表达呈负相关（r=0.63，P＜0.01），与 Bcl-2、PCNA的表达均呈正相关（r=0.35和0.70，均P＜0.05），见图4。

表2 结直肠癌组织和对应癌旁组织中Bax和Bcl-2表达水平比较

图3 结直肠癌组织和对应癌旁组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达的电泳图（ARMCX2为ARM重复X连锁蛋白2）

2.5 有无K-ras基因突变的结直肠癌组织中ARMCX2的表达比较 结直肠癌组织中有K-ras基因突变66例，无K-ras基因突变21例。有K-ras基因突变的结直肠癌组织中ARMCX2阳性表达率为85.7%（18/21），高于无K-ras基因突变的40.9%（27/66），差异有统计学意义（χ2=12.808，P＜0.01）。

2.6 ARMCX2表达阳性与阴性结直肠癌患者的生存分析 87例结直肠癌患者到随访截止时存活24例，死亡60例，失访3例；术后生存时间为10～60个月，中位生存时间29个月。生存分析显示ARMCX2的表达与生存时间有关（χ2=5.021，P＜0.05），见图 5。

3 讨论

ARMCX家族通过调控信号转导、调节细胞连接和细胞骨架蛋白的形成，对下游的细胞信号传递起重要作用[8]。但关于ARMCX2的研究较少，ARMCX2与ARMCX1具有高度同源性。ARMCX1参与了宫颈癌、乳腺癌和口腔鳞癌的增殖和凋亡，与肿瘤的发生有关[9-10]。笔者推测ARMCX2表达可能也参与肿瘤发生过程，本研究发现结直肠癌组织中ARMCX2的表达升高，且与肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移、血管淋巴管侵犯及TNM分期均有关，同时ARMCX2的表达与结直肠癌患者生存时间有关，提示ARMCX2表达升高是结直肠癌进程的重要因素，其高表达预示着结直肠癌不良预后。

研究报道ARMCX2参与调节细胞周期激酶的活性，使细胞在G0期的时间缩短[11]。PI3K导致ARMCX2的表达异常，引起下游核因子通路异常活化，调控肿瘤细胞的增殖过程[12-13]。本研究发现结直肠癌组织ARMCX2表达与凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达有关，提示ARMCX2高表达是促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡的重要分子因素。

K-ras基因突变存在于约20%的肿瘤中，K-ras通过上调血管内皮生长因子来诱导肿瘤的血管生成[14]。本研究发现有K-ras基因突变的结直肠癌组织中ARMCX2阳性表达率高于无K-ras基因突变，差异有统计学意义，提示ARMCX2可作为结直肠癌发展与预后的重要指标。

综上所述，结直肠癌中ARMCX2表达升高，其高表达在促进肿瘤细胞增殖和抑制凋亡的过程中有重要作用。ARMCX2与K-ras基因突变有关。ARMCX2可能是结直肠癌重要的预后因子。

图4 结直肠癌组织中ARM重复X连锁蛋白2（ARMCX2）与B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）、增殖细胞核抗原（PCNA）的相关性分析

图5 ARM重复X连锁蛋白2（ARMCX2）表达阳性与阴性结直肠癌患者的生存曲线比较