毕继才,刘四新,李从发

(1.河南科技学院食品学院,河南新乡453003;2.海南大学食品科学与工程学院,海南海口 570228;3.海南大学理学院,海南海口 570228)

静止培养Komagataeibacterxylinus时,在培养基表面生成白色薄膜凝胶状物质为细菌纤维素(Bacterial cellulose,BC)[1]。已报道的能产细菌纤维素的菌属有17个,分别是:Acetobacter(醋杆菌属)、Agrobaeterium(土壤杆菌属)、Achromobacrer(无色杆菌属)、Azotobacter(固氮菌属)、Aerobacter(气杆菌属)、Alcaligenes(产碱菌属)、Rhizobium(根瘤菌属)、Pseudomonas(假单胞菌属)、Sarcina(八叠球菌属)、Enterobacter(肠杆菌属)、Zoogloea(动胶菌属)、Salmonella(沙门氏菌属)、Vibrio(弧菌属)、Escherichia(埃希氏菌属)、Klebsiella(克雷伯氏菌属)、Glucoacetobacter(葡糖醋杆菌属)、Komagataeibacter(驹形氏杆菌属)[2-3]。发现最早也是研究最全面最透彻的是K.xylinus,也是阐述纤维素的生物合成及调控机制的模式菌株(Type strain)[4]。细菌纤维素生产菌株利用发酵培养基合成细菌纤维素,培养基成分可以通过抑制或激活微生物代谢途径中的酶或调控因子来影响代谢途径的选择和代谢速率。

图1 细菌纤维素生物合成与调控

细菌纤维素是典型的膳食纤维素,被美国FDA认定为公认安全级(Generally recognized as safe,GRAS)。细菌纤维素在食品行业可作为重要的食品添加剂、包装材料以及膳食纤维的来源[5-6]。这主要是基于其优越的食品学特性,如:a.细菌纤维素是由微生物产生的具有高纯度,不需要剧烈的化学处理的天然纤维素;b.细菌纤维素的生产可以用天然水果汁培养基,赋予细菌纤维素天然的果汁的香味和颜色;c.细菌纤维素可塑性极强,可以加工成任意形状,如薄膜、粒状、方形、长条形、球形以及一些特制的模具的形状,能够满足不同人群的消费需求;d.细菌纤维素具有纳米级的3D空间结构,可以用在新食品工业加工领域。e.细菌纤维素产生可以通过对生产菌株合成调控,这个特性将在现代食品3D打印技术领域运用具有良好的前景。

通过对细菌纤维素的生物合成和调控以及其在食品工业领域中的应用研究的梳理,可以为生产出更加符合食品工业需要的细菌纤维素产品提供新的思路。

1 细菌纤维素的生物合成

1.1 合成途径

Komagataeibacterxylinus是研究细菌纤维素的合成与调控以及分泌、组装和结晶的模式菌株。根据现在的研究进展,将其细菌纤维素的生物合成调控过程概括为(如图1)。

首先,是以Komagataeibacterxylinus利用葡萄糖和其他类型的碳源诸如甘油、乙醇、柠檬酸和丙酮酸等,分别通过葡萄糖转化途径、己糖单磷酸途径和三羧酸循环等将其产生细菌纤维素(如图2)[7-8]。

其次,产细菌纤维素的过程中影响其生物合成过程有两支旁路(如图2)。第一条支路是以葡萄糖和果糖作为唯一碳源时,通过葡萄糖己糖激酶和葡萄糖酸脱氢酶将葡萄糖转变为葡萄糖酮酸(Gluconic acid)[7]。利用G.xylinus作为生产细菌纤维素的菌株时随着葡萄糖酮酸的积累可以将发酵培养基中的pH降低[9],如果pH降低到生产菌株的可耐受pH以下,就会导致细胞的代谢活性降低而且细胞数量降低,从而导致细菌纤维素的产量降低。通过现代分子生物学的基因敲除(Gene knock-out)技术获得的一株不产葡萄糖脱氢酶的代谢缺陷型菌株,该菌株在以葡萄糖做为碳源的时候,在有氧条件发酵生产细菌纤维素,其产量可以提高1.7倍[10]。

第二支旁路是尿苷二磷酸葡萄糖在乙酰胶合成酶的催化下产生一种黏性多糖——乙酰胶[11-12](Acetan,其中葡萄糖∶葡萄糖醛酸∶甘露糖∶鼠李糖的含量比例为4∶1∶1∶1)。研究发现了一株G.xylinusBPR2001的乙酰胶缺陷型突变株EP1[13],影响细菌纤维素在动态培养产量的原因是：动态培养时乙酰胶增加了发酵液的黏度,防止菌体与细菌纤维素之间的交联凝聚,而使得细菌纤维素的产量提高。

图2 生物合成细菌纤维素过程中的两支旁路

最后,在细菌的细胞膜上利用冰冻蚀刻和电镜技术中能够观察到纤维素酶复合物,这些酶复合物称为终端复合物(Terminal complexes,简称TCs)[14-15]。通过细菌纤维素生产缺陷突变体的研究确定了其为四种基因组成分别为:CeSA、CeSB、CeSC和CeSD。其中CeSA、CeSB和CeSC参与细菌纤维素的合成;CeSD参与合成后的纤维素链的继续结晶化过程[16-17]。

1.2 细菌纤维素的生物合成调控

细菌纤维素的生物合成过程受到基因、代谢和细胞三个不同水平上的调控。

1.2.1 基因水平的调控 在G.xylinus是纤维素合成酶基因旁边发现三个上游基因和两种酶。在这三个基因中,推测第一个开放阅读框(ORF1)编码的是纤维素酶活性相关的酶(内切葡聚糖酶,Endoglucanase)[18],细菌和植物体内的内切葡聚糖酶被认为可能是纤维素合成中编辑/成链的终止子(Terminator)[19-20];第二个开放阅读框(ORF2)与形成细菌纤维素(天然纤维素I型)的高级结构有关,当以上两个基因中的任一个被破坏,G.xylinus就不能产生细菌纤维素[21];第三个开放阅读框(ORF3)可能在纤维素I和II间部分转化过程中起到关键作用[22]。在G.xylinus中含有一种膜蛋白,称为纤维素的补体因子(Cellulose complementing factor简称Ccp),具有与纤维素合成酶复合体(也称为终端复合物)相似的功能。细菌纤维素合成途径中可能仍然含有其他未知组分有待进一步研究[23]。

1.2.2 代谢水平的调控G.xylinus的细菌纤维素生物合成途径时,发现c-di-GMP(3′-5′-cyclic guanosine monophosphate,环-二鸟苷酸单磷酸)在细胞体内可通过与纤维素合成酶变构结合来激活纤维素合成酶活性[24]。研究表明c-di-GMP是在细菌中普遍存在的第二信使分子(Secondmessenger molecule),参与了细胞内多种生理功能的调节过程,如细胞分化(Cell differentiation)、产生致病因子、生物被膜(Biofilm)和细菌纤维素合成等。纤维素合成酶既直接参与细菌纤维素合成,又将它们变成网状结构。c-di-GMP作为变构效应因子(Allosteric effector)使纤维素合成酶构象发生变化,从而促进纤维素合成酶的反应活性。因此,当细胞内c-di-GMP浓度低时,纤维素合成能力就受到影响[25]。而c-di-GMP浓度受二鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶 A和磷酸二酯酶 B三种酶的调控[26]。二鸟苷酸环化酶有在原生质膜上和细胞质中两种形式;而磷酸二酯酶A和磷酸二酯酶B都位于原生质膜上。这三种酶形成了纤维素合成酶酶活性的多组分调节控制系统,与c-di-GMP的合成与降解相关。其具体步骤为:a.二鸟苷酸环化酶可催化c-di-GMP的生成,其活性受Mg2+的激活作用;b.磷酸二酯酶 A和磷酸二酯酶 B均可降解c-di-GMP,其中磷酸二酯酶 A的活性受到Ca2+、Fe2+、Ni+抑制,但受到Mg2+、Mn2+、Co3+的激活,而磷酸二酯酶 B不受Ca2+、Fe2+、Ni+影响。磷酸二酯酶 A 催化c-di-GMP成为无活性的线性pGpG,磷酸二酯酶 B进一步将pGpG 转化为两个5′-GMP。其中磷酸二酯酶 A的催化步骤是最关键的,Ca2+对磷酸二酯酶 A的抑制作用则提供了纤维素合成的另一个调控位点,Ca2+浓度会间接地影响纤维素的合成速率,而高浓度Ca2+可防止纤维素合成酶失活,并可提高纤维素的合成速率。

1.2.3 细胞水平的调控 为了提高纤维素产量,将氨苄青霉素抗性基因构建到G.xylinus和大肠杆菌之间的穿梭质粒(pUF106)上[20]。将带有目的基因片段的pUF106电转进目标菌株,可利用含氨苄青霉素的平板筛选转化成功的菌株。这为使用DNA重组技术将G.xylinus的细菌纤维素合成基因转进生长速度迅速的菌株如大肠杆菌,并在这些菌株里生产细菌纤维素成为可能。另外一个团队利用基因工程的方法得到了G.xylinus突变体,该菌株的葡糖酸形成途径被抑制[27]。从而防止在培养过程中pH的大幅度降低,膜状纤维素产量是野生型菌株的两倍,可以作为细菌纤维素工业化生产的菌株。

1.3 细菌纤维素的分泌、组装和结晶过程研究

K.xylinus是研究细菌纤维素分泌、组装和结晶三个过程的模式菌株。K.xylinus产生的细菌纤维素的生物合成与通过细胞膜上的微孔分泌到菌体细胞外这两个过程是同时进行[28]。Kai利用原子力显微镜技术研究细菌纤维素的纤维束/纤维带的形成过程[29]。每个G.xylinus两侧每隔约为1.0 nm就有一个微孔,菌体周身轴向排列分布着约100～160个微孔。微孔的功能能够使可溶性单根亚原纤维素链最终形成不溶性细菌纤维素丝带,24～48 h后能形成一个纤维束[29]。利用透射电子显微镜测量一个纤维束大约包含46根微纤维横截面平均是1.6 nm×5.8 nm。随后的研究表明一个完整的纤维束的宽度在40～60 nm之间,其包含的微纤维的宽度在3～4 nm之间[30]。细菌纤维束能够通过以下三种途径形成:单根纤维素与单根纤维素之间结合;扭曲的纤维素促进更大的稳定的纤维的形成;其他胶体物质,如细菌分泌的胞外多糖,可促使纤维素之间的粘附,是物理变化过程。形成的纳米纤维带将菌体包围,并随着菌体细胞分裂的而延伸增长。众多细菌产生许多纤维带,它们之间相互交织,最终能够形成显微状态下无规则的网状结构;而每个菌体镶嵌在由自己编织的纤维网络中,并在发酵培养基中编织一个个纤维网状的无纺布(Non-woven fabric)[31-32]。通过研究细菌纤维素的合成过程,可以有的放矢地改变细菌纤维素的物理化学性能,从而达到食品工业中所需要的产品特征。为在食品中更广泛应用提供优质原料。

2 应用于食品领域

2.1 作为食品原料

细菌纤维素(食品行业又叫椰果)本身就是一种高纤维素、低脂肪、低热量的传统食材[33]。它是东南亚菲律宾的传统甜点,当地也称之为Nata。可以根据生产细菌纤维素的培养基的不同而有不同的名字,如用椰子生产的叫Nata de coco,用菠萝汁生产的叫Nata de pina[34]。此类甜品具有爽滑、脆嫩的口感,而且可以赋予多种独特的风味而备受广大消费者青睐。在我国已广泛应用于饮料、乳制品、果冻、冰淇淋、糖果、烘焙、罐头等食品行业[35-39]。

细菌纤维素可以用作保健食品开发材料。研究表明,在模拟消化道中细菌纤维素可以降低胆固醇的含量[40]。Chau等[41]进行人体实验表明细菌纤维素可以显著降低人体血清甘油三酯、血清总胆固醇、肝胆固醇等指标。将红曲霉属的丝状真菌与产细菌纤维素菌株共同发酵可获得红色的红曲椰果,其味道如肉可做为素食主义者理想的肉类和海鲜的替代品[42-44]。细菌纤维素必将不断出现在未来的营养保健产品中。

2.2 作为食品添加剂

由于细菌纤维素凝胶具有很高的持水性、低固形物含量和高胶体强度,而且在低浓度,宽范围pH和温度下仍可保持稳定性。首先,细菌纤维素常用作食品成型剂、增稠剂、分散剂、成型剂和高档乳化剂等[45]。研究表明,在低温下细菌纤维素具有较好的冷冻保护性质,因此BC常用于于酸奶、奶酪等乳制品,主要起到对活性乳酸菌进行冷藏保护作用[46]。其次,由于细菌纤维素可以改变食品流变学性质,因此可以用作增稠剂、胶凝剂和保护剂等[35-37]。研究表明细菌纤维素添加量为1.0 kg/t时,冰淇淋有较好的抗融性和抗热冲击性[47]。最后,细菌纤维素属于人体不能消化吸收的膳食纤维,属于低热量原料,还能保持食品的口感细腻。在肉丸里添加10%的细菌纤维素可以保持肉丸的口感,因此细菌纤维素被认为是食品里肥肉的替代品[48]。Lin等[49]用细菌纤维素代替鱼肉酱里的脂肪取得了良好的效果。

2.3 作为食品包装材料

细菌纤维素经过改性可以作为优良的食品包装材料。食品的包装材料要求必须具备优良的阻隔性能,经过酯化的细菌纤维素膜对蒸汽和气体有良好的阻隔性能[50]。多聚乳酸与细菌纤维素的复合物材料,具有更好的机械性能、透明性和生物相容性[51]。在细菌纤维素里添加防腐剂Nisin制备的包装材料具有抑制Listeriamonocytogenes和全部的好氧菌的功能,是提高预包装食品的安全和延长货架期的一个良好包装材料[52]。科研工作者在细菌纤维素里进一步添加其他抗菌物质,如山梨酸、金属纳米粒子如铜、金、银和氧化锌等,制成的包装材料同样具有抗菌效果[53-55]。随着3D打印技术的日渐成熟[56],用3D打印技术制备的新型细菌纤维素包装材料也将成为一个新的研究领域。

3 结语与展望

细菌纤维素作为一种新兴的生物材料,被广泛应用于食品领域,具有良好的发展前景。目前,虽然细菌纤维素在食品行业的应用规模较大,但依旧存在产品品种单一等问题,主要集中在传统食品上,附加值不高。成本和产量仍然是制约细菌纤维素在食品行业大规模发展与应用的关键因素,因此寻求细菌纤维素合成的稳定高产菌株,通过调控细菌纤维素的合成来缩短发酵培养周期,丰富原料来源,进一步提高产量、降低生产成本及作为高附加值食品包装材料等是现阶段细菌纤维素在食品领域的研究重点和需要解决的关键问题。