相雪莲，许丹宁，曹 楠，钱 隆，田允波，李婉雁

(1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东 广州 510225)

规模化养殖作为未来养殖模式的主流，对动物疫病的防控提出了更高的要求，因此，开发无毒、无残留的免疫调节剂以提高动物机体的抗病能力显得尤为重要。白术多糖(Polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)作为中药白术的主要有效成分，可提高动物机体免疫力，并具有抗炎、抗肿瘤、抗应激等作用[1]。大量前期研究结果表明，PAMK具有提高免疫器官指数、提高淋巴细胞增殖和转化、调节细胞因子的分泌及纠正T淋巴细胞亚群分布紊乱等免疫活性效应[2-4]，但关于对免疫抑制动物白细胞形态和功能方面的报道较少。据此，本试验利用环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)小鼠模型，初步探讨了PAMK对免疫抑制小鼠白细胞数量、形态及功能的影响，为多糖类免疫调节剂的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只5周龄SPF级昆明小鼠，雌性，购自南方医科大学动物科学实验中心。

1.2 试验分组及处理 小鼠随机分为4组，每组15只，分别为对照组(N)、环磷酰胺组(H)、白术多糖组(B)和白术多糖+环磷酰胺组(BH)。B组和BH组小鼠灌胃PAMK 200 mg/(kg·bw)，另两组灌胃生理盐水0.5 mL，1次/d，连续28 d。H组和BH组小鼠在29 d、30 d、31 d连续腹腔注射CTX 80 mg/(kg·bw)，另两组小鼠腹腔注射0.5 mL生理盐水。35 d采集样品并保存。

1.3 主要仪器 全自动酶标仪(ELX800)，购自美国博腾仪器公司；分光光度计(UV-3100)，购自MAPADA 公司；定量溶光光度分析仪(T6)，购自北京普析有限公司；比浊仪(Wi94748)，购自东西仪科技有限公司；生化培养箱(HCS-65A-A)，购自广州恒创有限公司；透射电子显微镜(JEM-1400)，购自日本电子株式会社公司；光学显微镜(ECLIPSE E100)，购自Nikon公司。

1.4 主要药品和试剂 白术多糖(20160323)，购自西安天园生物制剂厂；注射用环磷酰胺(H14023686)，购自山西普德药业有限公司；金黄色葡萄球菌(FSCC223005)，购自广东环凯微生物科技有限公司；ELISA试剂盒(XY-ELA9021)，购自上海心语生物科技有限公司；豚鼠血清(HQ30076)，购自广东鸿泉生物科技有限公司；绵羊红细胞(HQ80073)，购自广东鸿泉生物科技有限公司；瑞士-吉姆萨染液(416093)，购自珠海贝索生物技术公司；H.E.染液(DH0006)，购自LEAGENE公司。

1.5 试验方法

1.5.1 样品采集及预处理 采集样品前，小鼠禁食12 h，禁水6 h，乙醚麻醉，剪去尾尖，取约2 μL血液制备血涂片，瑞氏-吉姆萨法染色，光学显微镜下观察白细胞，取400倍30个视野，计算白细胞总数，计数200个白细胞用于比例计算；眼静脉取血分别制备抗凝血及血清，用于相关指标检测；快速收取1～3 mm3的脾脏、胸腺组织置于2.5% 戊二醛溶液保存，送广州金域医学检验中心制备透射电镜切片及拍照观察；取小鼠左侧股骨置于福尔马林溶液浸泡保存，用于石蜡切片制备。

1.5.2 中性粒细胞吞噬能力测定 将新鲜抗凝血和金黄色葡萄球菌液以2∶1比例混合，置37 ℃水浴30 min，每隔15 min轻轻摇晃均匀。室温下3 000 r/min离心10 min。吸取约3 μL中间白细胞层液体，制备白细胞涂片，瑞氏-吉姆萨法染色，计数100个中性粒细胞，用于中性粒细胞吞噬百分比及吞噬指数计算，公式如下：

1.5.3 血清中IL-2浓度检测 按ELISA试剂盒操作说明书进行IL-2浓度的测定。

1.5.4 B淋巴细胞产生抗体能力检测 小鼠腹腔注射绵羊红细胞，处理5 d后，无菌摘取脾脏，分离淋巴细胞，台盼蓝染色检测细胞活性在95%以上，将细胞浓度调整为5×106个/mL，淋巴细胞悬液10 μL 取加入体积分数为10%的绵羊红细胞0.5 mL，补体1 mL，37 ℃水浴30 min，2 000 r/min离心10 min，取上清，分光光度计波长413 nm处测定OD值。

1.5.5 统计分析 采用Prism 5.0(GraphPad Software，CA，USA)软件处理数据，选择单因素方差分析，Tukey多重比较法进行多组间差异比较，文中数据均以平均值±标准差(Mean±SD)表示，股骨组织切片采用CCD显微成像分析系统进行拍照分析。

2 结果

2.1 白术多糖对小鼠外周血白细胞数量以及比例的影响 结果如表1所示，小鼠经环磷酰胺诱导后，外周血中白细胞数量和淋巴细胞比例与对照组相比显著下降(P<0.05)，中性粒细胞百分比显著上升(P<0.05)，单核细胞及嗜酸性粒细胞比例无明显变化(P>0.05)。白术多糖组小鼠的白细胞数量及比例与对照组差异不显著(P>0.05)，灌服白术多糖能显著提高免疫抑制小鼠的白细胞数量(P<0.05)，但仍低于对照组及白术多糖组(P<0.05)，对淋巴细胞及中性粒细胞比例也无明显影响(P>0.05)。

表1 白术多糖对小鼠白细胞数量及比例的影响

2.2 白术多糖对小鼠胸腺、脾脏超微结构的影响 从图1可以看出，对照组及白术多糖组小鼠胸腺组织致密，细胞排列有序(图1A，1E)，可见发育不同时期的胸腺细胞及胸腺上皮细胞，胸腺细胞核内易染色质呈团块状沿核周分布，核质比高，胞膜上突起少，细胞器较少(图1B，1E)。免疫抑制小鼠胸腺组织中，正常细胞数量明显减少(图1C)，胸腺细胞核内染色质多出现边集，可见凋亡小体、髓样小体及变性泡状结构(图1D)，并伴有电子密度颗粒沉积。灌胃白术多糖可明显增加免疫抑制小鼠胸腺组织密度(图1G)，胸腺细胞形态正常，但胸腺细胞胞浆内细胞器多于对照组及白术多糖组，仍有细胞凋亡现象(图1H)，未见髓样小体，整体细胞状态较免疫抑制小鼠有明显好转。

图2表明，对照组及白术多糖组小鼠脾脏组织结构正常，可见T淋巴细胞(图2F)、浆细胞(图2B)、中性粒细胞、单核细胞等，细胞形态规则，偶见凋亡初期细胞(图2A，2E)。环磷酰胺组小鼠脾脏结构明显异常，细胞数量减少，细胞核电子密度降低，染色质减少，可见较多细胞凋亡(图2D)，染色质边集、核固缩现象明显，出现大量巨型转化淋巴细胞(图2C)，胞浆内充满大量扩展、泡状光面内质网，胞核异型度高，多核。灌胃白术多糖对免疫抑制小鼠的脾脏结构有明显修复作用，组织致密性增加(图2G)，巨型转化淋巴细胞及凋亡细胞数量明显减少，但胞浆中细胞器损伤仍较严重(图2H)。

2.3 白术多糖对小鼠股骨骨髓细胞的影响 封二彩版图3结果显示，对照组和白术多糖组小鼠股骨组织结构正常，骨髓细胞数量多，粒细胞系、红细胞系、淋巴细胞系的细胞发育良好(封二彩版图3A，3B，3E，3F)，环磷酰胺诱导小鼠的股骨组织疏松，各系细胞及巨核细胞数量明显减少，出现脂肪空泡，细胞核淡染，染色质缺失，成熟红细胞数量也明显减少(封二彩版图3C，3D)。添加白术多糖以后，环磷酰胺组小鼠骨髓结构有了明显的改善，骨髓细胞数量增多，但细胞核淡染现象依旧比较严重(封二彩版图3G，3H)。

2.4 白术多糖对小鼠白细胞功能的影响 由图4可知，和对照组相比，环磷酰胺组小鼠的中性粒细胞吞噬百分数、中性粒细胞吞噬指数、IL-2浓度以及B淋巴细胞分泌抗体量水平均显著降低(P<0.05)。白术多糖可以显著提高免疫抑制小鼠的中性粒细胞吞噬能力、血清中IL-2含量以及B淋巴细胞分泌抗体水平(P<0.05)，达到对照组水平(P>0.05)，而白术多糖还可以显著提高正常小鼠淋巴细胞分泌细胞因子及抗体能力(P<0.05)。

图4 PAMK对免疫抑制小鼠白细胞功能的影响

3 讨论

环磷酰胺是制备免疫抑制动物模型的常用药物，通过抑制骨髓造血干/祖细胞，引起白细胞减少症，导致免疫功能低下[5-6]。本试验采用80 mg/(kg·bw)剂量CTX诱导小鼠，发现小鼠外周血中白细胞数量急剧减少，白细胞比例紊乱，骨髓细胞损伤严重，胸腺及脾脏中死亡及凋亡细胞明显增多，对T、B淋巴细胞及中性粒细胞的功能也有强烈的抑制作用，这与许多相关领域的研究结果一致[7-9]。

白细胞是机体防御系统的重要组成部分，起源于骨髓造血干细胞，在骨髓及胸腺中发育分化后，在血液及脾脏中执行功能，计算白细胞数量及比例是评估免疫功能的有效方法。本试验结果显示，白术多糖对正常小鼠白细胞的数量及比例无明显干预作用，对免疫抑制小鼠外周血中白细胞数量有明显的提升作用，但不能改变淋巴细胞及中性粒细胞比例紊乱现象，这可能与环磷酰胺的免疫抑制机制有关。环磷酰胺作为治疗癌症、自身免疫及免疫介导疾病的药物，主要免疫抑制机制是使T、B淋巴细胞绝对数目减少[5]，这种机制除了通过抑制骨髓造血干细胞外，对外周血中成熟的淋巴细胞更具有直接杀伤效果。而白术多糖作为一种调节性免疫增强剂，并不能彻底纠正这种免疫抑制现象。试验数据尽管没有统计学意义，但能看出淋巴细胞百分比有上升的趋势。Li W Y等在研究中也发现，白术多糖可以纠正因环磷酰胺所致的雏鹅白细胞比例失衡，并能明显提高T、B淋巴细胞的体外增殖能力[10]，还有其他一些中草药活性物质也都能够明显改善环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠白细胞减少现象[11-12]。

骨髓、胸腺及脾脏是白细胞发育、分化及执行功能的场所。骨髓组织在环磷酰胺的作用下，骨髓细胞数量明显减少，相对淋巴系及红系细胞而言，粒细胞系损伤最轻，而白术多糖能够明显增加骨髓细胞的数量，从而拮抗环磷酰胺的抑制作用。胸腺是T淋巴细胞发育分化场所，超微结构的结果显示，环磷酰胺对胸腺细胞的破坏程度最严重，主要体现在不同发育时期淋巴细胞的数量急剧减少、凋亡及坏死现象增多。进行白术多糖干预后，胸腺细胞的数量明显增多，细胞形态有明显的改善，凋亡细胞数量也显著减少。脾脏在环磷酰胺的作用下出现了大量的巨型转化淋巴细胞及凋亡细胞，说明环磷酰胺对淋巴细胞的破坏最严重，而白术多糖能够明显减少巨型转化淋巴细胞的数量，并能使脾脏中的淋巴细胞保持正常形态，同时也减少了坏死和凋亡的细胞，综合分析发现，白术多糖对造血及免疫器官中淋巴细胞的修复作用比较显著，但对淋巴细胞总量的提升作用不明显。

白术多糖虽然对正常小鼠白细胞数量、比例及组织细胞没有正向或负向的干预作用，但对正常小鼠的T、B淋巴细胞功能有显著的促进作用。T淋巴细胞是IL-2的主要产生者，IL-2的分泌水平是衡量T淋巴细胞功能的重要指标，同时IL-2对胸腺中的调节性T细胞的发育也有重要影响[13]，本试验结果发现，白术多糖对正常小鼠血清中IL-2的含量有明显的提升作用，从而可以推断，白术多糖对胸腺中T细胞的分化也有一定的促进作用。体液免疫主要是通过B淋巴细胞转化成浆细胞分泌抗体及激活相关免疫细胞分泌细胞因子来发挥作用，B淋巴细胞表面有免疫球蛋白(BCR)，特异抗原只能和相应的受体结合才能发挥作用，因此B淋巴细胞产生抗体量是衡量体液免疫的重要指标。已有研究发现，多糖可以提高机体的体液免疫功能，例如玉屏风多糖能够提高绵羊红细胞处理时B淋巴细胞分泌的抗体量，从而提高小鼠的体液免疫功能[14]。而白术多糖也能够显著高正常小鼠B淋巴细胞分泌抗体的能力，上述研究结果证实了在正常生理条件下，白术多糖通过提高淋巴细胞的功能，从而增强机体的特异性免疫功能。李鹏等[15]也从血清抗体的测定、脾淋巴细胞的转化能力角度证实了白术多糖对正常小鼠特异性免疫具有调节作用。

白术多糖对免疫抑制小鼠的白细胞功能则表现出了明显的正向调节作用，4种指标均恢复至对照组水平。中性粒细胞的吞噬指标是评定功能的重要指标，吞噬能力越强，则代表中性粒细胞的功能越完善，能够在短时间内发挥强大的防御作用。白术多糖虽然不能提升正常小鼠中性粒细胞的吞噬能力，但可增强免疫抑制小鼠的中性粒细胞功能，原因可能是白术多糖可以明显修复骨髓粒细胞系，增加了外周血中中性粒细胞的数量并增强其活力。试验结果进一步显示，在机体免疫功能低下时，白术多糖能从非特异性和特异性免疫角度全面改善机体的防御能力，显示出了强大的免疫促进作用。

综上所述，白术多糖可以通过提高白细胞数量、修复骨髓、脾脏及胸腺的组织结构、提高白细胞功能等途径减轻环磷酰胺对小鼠白细胞的抑制和破坏作用，并对正常小鼠的淋巴细胞功能具有明显的提升作用。本试验初步探索了白术多糖对免疫抑制小鼠白细胞的保护作用，为进一步研究白术多糖的作用机制及临床应用提供了基础数据。