房 柳 王艳成 董微巍 姬文秀

(延边大学农学院，吉林 延吉 133000)

人参(PanaxginsengC.A.Meyer)，素有“百草之王”之美称，是中国中医药宝库中的瑰宝，也是吉林省得天独厚的特产资源，目前已有3 000多年的应用历史[1]。由于人参具有免疫调节、抗癌、抗氧化、治疗糖尿病和抗炎等药理活性[2-6]。经过多年来的产业培育，人参开始走出中药柜，被作为主要活性成分添加到食品、保健品之中，用来提高其产品功能性。人参皂苷是人参的主要活性成分，主要包括Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2和Rd等人参主皂苷和一些含量甚微的Rg3、compound K、Rh1、Rh2、Rh3等稀有人参皂苷，不同种类的人参皂苷具有不同的药理活性。研究[7]表明，人参皂苷经水解(脱糖基)作用脱去糖基，转化为稀有人参皂苷，稀有人参皂苷所含糖基少，生物利用度和药理活性高。孙广仁等[8]开发了一种多菌种发酵人参酒，人参酒发酵产生稀有皂苷提高了其功能性，改善了人参酒风味。蔡爽[9]开发了一种人参术苓酵素，发酵使人参皂苷转化，具有缓解非溃疡性消化不良的功效。筛选有利于人参发酵、高效转化人参皂苷的功能菌株，提高人参产品功能性，体外合成稀有人参皂苷已成为国内外学者们所关注的焦点[10-12]。

昆虫体内共生菌生存环境独特，积累着大量具有特殊生理活性和功能的物质，也是人们发现微生物新物种和制备较好生物活性代谢产物的重要来源。目前多利用昆虫共生菌中纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等分解纤维素、木质素、制备生物农药等研究[13]，对开发利用昆虫共生功能菌改性中草药活性的研究报道很少。利用昆虫内生菌资源发酵改性中草药提高其功能与活性，为中草药及其功能产品发酵提供微生物资源目前已日益被关注。Wang等[14]利用冬虫夏草中真菌高效转化人参皂苷Rb1→Rd→F2→compound K，转化率高达82%，制得compound K纯度高达91%。冬虫夏草是中国青藏高原特有的名贵药材，其资源稀少，价格昂贵，限制了它的广泛使用[15]。药用昆虫洋虫(Martianusdermestoides)主要以中药人参、茯苓、红花等为食，根据其习性推测洋虫体内具有降解人参皂苷功能菌株。前期课题组成员[16]对洋虫幼虫和成虫内生菌组成结构进行了系统分析，结果表明，洋虫内不可培养的和未被分类的菌种占一定的比例，洋虫体内共生菌是庞大的动态微生物寄居场所，是有待开发的生物资源。试验拟利用动物药洋虫内特殊生境的微生物进行产β-葡萄糖苷酶功能菌株筛选、鉴定，并与植物药人参中全组分人参皂苷发酵反应制备人参稀有皂苷(Rg3、Rh1和compound K)，以期改善人参生物利用度。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

洋虫：延边大学植物保护实验室；

鲜人参根(4年生植物)：吉林集安；

正丁醇、甲醇、无水乙醇等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

PCR相关试剂：美国Genview公司；

色谱级乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和去离子水：色谱级，美国费希尔科学世界公司；

人参皂苷标准品(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh1、Rg2、Rg3、F1和compound K)：国家标准物质网；

真菌DNA提取试剂盒：上海生工生物工程有限公司；

PCR扩增仪：2720-Thermal-Cycler型，美国应用生物系统公司；

高效液相色谱仪：Aglient1260LC型，安捷伦科技有限公司；

电子天平：YP600型，天津天马横基仪器有限公司；

离心沉淀器：80-2型，天津赛得利斯实验仪器分析制造厂；

旋转蒸发仪：RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂；

恒温水浴锅：HH-S8A型，上海仪器仪表科技有限公司。

1.2 人参皂苷提取物

取新鲜人参根(4年生植物)样品干燥并粉碎，取10 g粉末在82 ℃下用1 000 mL 80%乙醇回流冷凝2 h，反复两次，合并萃取液，减压浓缩后在50 ℃的烘箱中烘干，制备人参皂苷粗提物[17]。

1.3 洋虫内共生菌液制备

1.3.1 洋虫的饲养与驯化 按照80%红枣和20%人参的比例混合饲料饲养驯化洋虫，在30 cm×20 cm×10 cm培养箱中保持(24±2) ℃的温度，培养1年。每批幼虫培养15 d左右，装入昆虫培养箱，保持幼虫和成虫的适当密度，便于连续取食，保持种群的稳定。

1.3.2 洋虫内共生菌液制备 取洋虫成虫15只，置于75%乙醇中90 s，用无菌水反复冲洗，在无菌操作台用研钵研磨，加极少量蒸馏水移至离心管；先以500 r/min离心5 min，取出上清液，再以10 000 r/min离心5 min，取下方沉淀，加入生理盐水制备洋虫内共生菌菌液。

1.4 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选与鉴定

1.4.1 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选 利用10倍稀释法逐级稀释菌液，然后取100 μL洋虫菌液加到MRS筛选培养基(加入七叶苷、柠檬酸铁)上，采用涂布平板法将菌液在培养基上涂布均匀，密封，厌氧条件下恒温培养箱中倒置培养72 h，观察其生长状况。挑选菌落呈黑色且边缘整齐的单一菌落，利用划线法将其接种到新的培养基上，多次重复直至得到单一菌株。从中挑选两株生长状态良好且菌落颜色较深的菌株进行后续试验[18]。

1.4.2 产β-葡萄糖苷酶功能菌株的鉴定 DP336 试剂盒提取基因组DNA，序列通用引物(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3’)进行PCR 扩增，PCR产物的测序工作由北京百迈客有限公司完成。

1.5 菌液与人参皂苷提取物发酵反应

取4 mg人参皂苷粗提物，加入500 μL菌液至2 mL离心管中，在85% N2、10% H2和5% CO2的厌氧条件下，将筛选出的菌株以及二者的混合菌株富集培养24 h，取人参主皂苷与菌液反应20 d，采用高效液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)对不同发酵时间(0，1，2，3，7，12，20 d)下的生物转化产物进行研究。

1.6 LC-MS/MS分析产物

发酵产物经饱和正丁醇3倍体积萃取，以5 000 r/min离心5 min，取上清液，反复3次；将萃取出的菌液旋转蒸发至膏状，加入100 μL液相甲醇，移至液相小瓶，LC-MS/MS分析。安捷伦1260系列液相色谱系统与安捷伦Poroshell ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和C18保护柱对其进行检测分析。该系统使用Mass Hunter采集软件B.07.00进行操作。流动相由水(0.1%甲酸，溶剂A)和乙腈(0.1%甲酸，溶剂B)组成，采用以下梯度洗脱程序：0～13 min，0%～23% B；13～33 min，23%～46% B；33～38 min，46%～68% B；38～45 min，68%～68% B；45～55 min，68%～100% B。进样量2 μL，流速0.5 mL/min，检测波长203 nm。

利用安捷伦6420型三重四极质谱仪(QQQ-MS)对化合物进行质谱分析。采用正电喷雾离子化(ESI)MS-MS对人参皂苷的代谢产物进行分析。毛细管电压为4 000 V，气体以3 L/min的速度流动，气体温度为300 ℃。获得了m/z500～1 500质量范围内的全扫描质谱图。通过测定发酵产物中[M+Na]+或[M-2H2O+OH]+离子片段质量来确定人参皂苷含量。

1.7 方法验证

定量分析采用外标法。制备含有12种人参皂苷标准物质溶液，并稀释至适当浓度，以绘制标准曲线。通过绘制峰面积与各分析物浓度之间的关系，得到校正曲线。在色谱条件下，以信噪比S/N=3为检测限(LOD)、S/N=10为定量限(LOQ)为原则，计算12个目标分析物的检测限和定量限。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

利用七叶苷显色原理，即七叶苷被β-葡萄糖苷酶水解后生成的6,7-二羟香豆素也叫七叶苷元，与铁离子反应，使培养基内的菌落周围生成黑褐色物质，从洋虫成虫10个菌液样品体内筛选出2株具有产生β-葡萄糖苷酶的功能真菌，编号为WY1、WY2，经18S rRNA基因扩增分别对两株产β-葡萄糖苷酶真菌进行鉴定。洋虫内生真菌WY1经PCR扩增后获得1条558 bp左右的特异性条带，WY2经PCR扩增后获得1条598 bp左右的特异性条带，将序列提交至NCBI数据库，通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过软件CLUSTALX 1.83和MEGA 7.00构建系统发育树(见图1)。

通过系统发育树分析结果表明，WY1序列与菌株Chaetomiumglobosum相似度达98%，定性该菌株为Chaetomium属，WY2序列与菌株Aspergillusfumigatus相似度达93%，初步定性该菌株为Aspergillus属。

2.2 菌株与人参皂苷发酵反应

2.2.1 定量方法验证 对一定浓度范围内的人参皂苷标椎品线性校准曲线进行分析，并进行线性回归计算，按3倍信噪比和10倍信噪比计算方法分别确定检出限和定量限，参数与结果见表1。

如表1所示，在质量浓度50～5 000 ng/mL范围内，相关系数均大于0.992，所有分析物的浓度与峰面积呈良好的线性关系，可以满足12种人参皂苷标准化合物检测计算要求。

2.2.2 内生菌WY1与人参皂苷提取液发酵产物分析

利用内生菌WY1对人参皂苷提取液进行生物转化，通过HPLC-MS/MS对发酵产物中人参皂苷进行定性分析，检测结果如图2所示。

由图2可知，在人参粗提掖中共有7种人参主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY1作用下，发酵产物为稀有人参皂苷Rh1。

定量分析了人参主皂苷在WY1菌液作用下动态发酵过程发酵产物中人参皂苷的变化趋势，如图3所示。人参主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量随着与WY1菌液的发酵反应时间增长而逐渐减少，而人参主皂苷Rd含量呈先减少后升高的变化趋势。代谢初期Rd 被水解转化，在0～5 d其含量随着时间变化而逐渐减少，但是，由于二醇类人参皂苷Rb1、Rc、Rb2在发酵反应过程中水解掉C-20位外部糖基转化被转化生成Rd，在5～20 d 其含量又呈升高趋势，所以在WY1作用下转化途径是Rb1/Rb2/Rc→Rd。稀有人参皂苷Rh1是三醇类人参皂苷(Rg1，Re，Rf)主要发酵产物，其可能由于在WY1作用下人参皂苷Re水解掉C-6位外部糖基转化为人参皂苷Rg1，人参皂苷Rg1水解掉C-6位外部糖基转化为人参皂苷Rh1；Rf水解掉C-6位外部糖基直接转化为Rh1，其转化途径为Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1，为此，随着发酵反应进行人参皂苷Rh1含量逐渐升高。目前，稀有人参皂苷Rh1主要是通过合成和转化的方法来获取，其中微生物转化法具有反应体系稳定、菌种生长迅速且无需分离纯化酶液等优点，受到众多研究者的青睐[19]，试验从洋虫内分离的C. WY1可以与人参总皂苷发生去糖基化反应，将人参皂苷中二醇类皂苷转化为Rd，将三醇类皂苷生物转化为稀有皂苷Rh1，可为制备靶向制备Rh1发酵功能菌提供资源。

图1 菌株的系统发育树

2.2.3 内生菌WY2与人参皂苷提取液发酵产物分析

利用HPLC-MS/MS定性分析内生菌WY2对人参皂苷提取液发酵产物中的人参皂苷，发酵反应总离子色谱图如图4所示。

由图4可知，在人参粗提液中共有7种人参主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd)在WY2作用下，发酵产物为稀有人参皂苷Rh1、Rg3和compound K。定量分析了人参主皂苷在WY2菌液作用下动态发酵过程发酵产物中人参皂苷的变化趋势，如图5所示。

表1 12种人参皂苷的线性范围、回归方程、相关系数、检测限和定量限

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

图3 发酵过程中7种人参主皂苷含量及其转化产物Rh1随时间变化曲线

WY2菌液发酵人参皂苷(0，1，3，5，7，10，20 d)动态反应中，人参主皂苷浓度—时间曲线如图5(a)所示，人参主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量随着与WY2菌液的发酵反应时间增长而逐渐减少，发酵第3天产生稀有人参皂苷Rg3和compound K，其主要由于人参皂苷(Rb1、Rb2、Rc)水解掉C-20位外部糖基转化为人参皂苷Rd，Rd作为中间代谢产物水解掉C-20位糖基转化为人参皂苷Rg3，水解掉C-3位糖基转化为compound K，其转化途径为Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K，所以人参主皂苷Rd含量呈先减少后升高，Rg3和compound K含量随着发酵反应时间增长而增加的变化趋势。同2.3.1人参皂苷Rh1是三醇类皂苷Rg1、Re和Rf的主要转化产物，随着发酵反应进行含量逐渐升高。

烟曲霉WY2属曲霉菌属，目前在微生物转化领域具有一定的应用前景，如马宗敏等[20]采用黑曲霉对薯蓣科植物黄山药根茎进行微生物转化，转化后得到了4个化合物，左明星等[21]利用烟曲霉GZWMJZ-152将茶粕中的山茶苷代谢，从发酵提取物中分离得到5个化合物，其曲霉菌属在发酵中草药植物中已具有较高的研究价值。试验利用洋虫内分离的烟曲霉WY2转化人参皂苷萃取液新增了3种活性皂苷化合物。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

图5 WY2发酵7种人参主皂苷中发酵产物皂苷含量随时间变化曲线

2.2.4 内生菌WY1/WY2联合发酵人参皂苷提取液产物分析 利用HPLC-MS/MS定性分析内生菌WY1/WY2两菌按1∶1比例复合发酵人参皂苷，提取液产物中的人参皂苷，发酵反应总离子色谱图如图6所示。

由图6可知，人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2在联合菌剂作用下代谢转化的稀有人参皂苷分别为Rh1、Rg3和compound K。WY1/WY2联合菌剂发酵人参皂苷在(0，1，3，5，7，10，20 d)动态反应中定量分析了两株菌株联合发酵转化人参皂苷的反应产物，人参皂苷成分随时间变化曲线如图7所示。

1. Re 2. Rg1 3. Rf 4. Rb1 5. Rc 6. Rb2 7. Rg2 8. Rd 9. Rh1 10. F1 11. Rg3 12. compound K

图7 WY1/WY2发酵7种人参主皂苷中发酵产物中皂苷含量随时间变化曲线

由图7(a)可知，人参主皂苷(Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2)含量随着发酵反应时间增长逐渐减少，人参皂苷Rd因在WY1/WY2作用下发生水解反应，发酵初期因被水解而呈减少趋势，但由于二醇类主皂苷(Rb1、Rc和Rb2)在发酵过程中产生了人参皂苷Rd，其含量在3 d后开始出现逐渐升高趋势。三醇类皂苷反应产物稀有人参皂苷Rh1在发酵第1天开始产生，随着发酵反应进行含量逐渐升高，在发酵第3天产生稀有人参皂苷Rg3和compound K，其含量随着发酵反应时间增长而增加，转化机制同2.3.2所述。

微生物在生长发酵过程中会产生很多酶，具有强大的代谢能力，可以提高中药的有效成分含量。WY1/WY2双菌联合发酵，可改善人参皂苷生物活性，与单一菌株相比可提高稀有人参皂苷Rh1、Rg3和compound K的转化效率。相关的研究[22]以及生产实践表明，使用多种菌株进行混合发酵制备的相关产品，与单一菌种发酵相比，具有更好的品质与效果，在试验的两种菌株作用下人参二醇类皂苷比人参三醇类皂苷更容易被转化，二醇类主皂苷大部分被转化为稀有人参皂苷Rg3。

3 结论

筛选出两株洋虫体内共生产β-葡萄糖苷酶真菌ChaetomiumglobosumWY1和AspergillusfumigatusWY2及WY1/WY2联合菌剂分别与全组分人参皂苷发酵培养，通过比较WY1/WY2联合菌剂转化制备稀有人参皂苷Rh1、Rg3和compound K较为高效，转化途径为Re→Rg1→Rh1；Rf→Rh1；Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K。为了更好地提高人参皂苷的转化效率，该研究将继续对WY1/ WY2联合菌剂的培养条件pH、温度、培养基等进行优化。