禹靓倩， 吴 毅， 彭继庆， 李娇婕， 谭志超， 曹基武

(1.中南林业科技大学林学院， 湖南 长沙 410004； 2.临武县恒心生态农业发展有限责任公司， 湖南 临武 424300)

栎属Quercus为壳斗科Fagaceae常绿或落叶乔木、稀灌木，其树种具有寿命长、生物量大、根系发达、抗逆性强、林冠层茂密、层片结构复杂、生物多样性指数高等特点[1]，是常见的森林建群树种，对于丰富我国造林树种资源、提升苗木产业化水平，维持生态平衡、保护生态安全、推动生态文明建设方面具有重要意义。栎属树种木材密度大于0.75 g·cm-3，属于优质硬木，果实富含淀粉与糖，树皮、枝叶、种壳中富含制革工业所需的重要原料——鞣质，经济价值高。栎属树种在全球分布广泛，约有450种，其中我国有51种，主要分布在四川、云南、贵州、西藏、陕西、浙江、山东等地，是栎属树种分布较多的国家之一[2]。栎属树种种间在性状上有较多交叉，导致产生了多系类群，利用合适的分子标记进行系统研究，成为解决植物类群网状进化的有效途径。前人已经利用RAPD标记对秦岭4个类型的天然栓皮栎种群进行了研究，结果表明栓皮栎的总体遗传多样性水平高、遗传分化大、遗传变异高，其UPGMA聚类结果也与形态学分类基本一致[3]；秦英英等[4]运用SSR标记对山西省辽东栎自然居群遗传多样性进行了研究，结果表明辽东栎群体绝大多数遗传变异发生在群体内，并且遗传距离与地理距离之间具有显著的正相关关系。除此之外，还有学者对蒙古栎、无梗花栎、夏栎、欧洲栓皮栎进行EST-SSR信息分析，了解了四种栎类不同基元的EST-SSR的分布频率具有非常一致的特征[5]；利用AFLP标记对不同海拔的川滇高山栎进行了研究，发现随着海拔高度的降低，其遗传变异水平呈由低到高再到低的分布[6-7]。ISSR(简单重复间区序列，intersimple sequence repeat)是基于SSR发展起来的一种分子标记技术，该技术的多态性及可重复性高、试验操作简单、成本低、还可揭示基因组水平的某些特征，且呈孟德尔式遗传，因此该技术在遗传多样性研究中被充分利用[8]。以往的研究往往局限于单种或者少量种内部多样性比较和简单的类群划分，有关大样本不同种(品种)群间的多样性差异以及亲缘关系研究还不清楚。本研究对栎属27种树种进行ISSR标记分析，探讨种间和品种间的亲缘关系，以期为栎属树种的遗传多样性检测、品种鉴定、系统分类以及新品种培育的亲本选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料分别来源于湖南长沙中南林业科技大学校区、山东日照、黑龙江鸡西与西藏拉萨4个引种栽培区，共27种(见表1)。采集同一株上叶片完整、生长状况好、无病虫害的5～8片新鲜叶片作为试验材料，用湿纱布擦净后封入自封袋中，需将采集的样品尽快带回实验室，置于-70 ℃超低温冰箱中保存备用。

表1 试验材料及来源Tab.1 Experimental material and source序号名称学名采集地点1短柄枹栎Q. serrata湖南长沙2弗吉尼亚栎Q. virginiana 湖南长沙3小叶栎Q. chenii湖南长沙4栓皮栎Q. variabilis湖南长沙5娜塔栎Q. nuttallii湖南长沙6舒马栎Q. shumardii湖南长沙7夏栎Q. robur湖南长沙8针栎Q. palustris湖南长沙9蒙古栎Q. mongolica黑龙江鸡西10川滇高山栎Q. aquifolioides西藏拉萨11柳叶栎Q. phellos湖南长沙12南方红栎Q. falcata湖南长沙13麻栎Q. acutissima湖南长沙14大果栎Q. macrocarpa湖南长沙15水栎Q. nigra湖南长沙16白栎Q. fabri湖南长沙17椭圆果栎Q. ellip-soidalis山东日照18星毛栎Q. stellata山东日照19北美红栎Q. rubra湖南长沙20月桂叶栎Q. hemisphaerica湖南长沙21乌冈栎Q. phillyraeoides湖南长沙22加州白栎Q. lyrata山东日照23沼生栎Q. palustris湖南长沙24无柄栎Q. imbricaria湖南长沙25沼生栗栎Q. michauxii山东日照26北方针栎Q. ellipsoidalis山东日照27沼生红栎Q. shumardii湖南长沙

1.2 DNA提取与检测

试验在中南林业科技大学实验室进行。将采集到的叶片用液氮研磨成粉末后装入离心管，随后采用北京天根生物科技有限责任公司的植物基因组DNA提取试剂盒对27种栎属树种进行DNA的提取，操作步骤按照说明书要求进行适当调整。使用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行检测，选取出条带清晰、没有拖带、没有受到RNA及蛋白质污染的样品，利用紫外分光光度法测定DNA的纯度与浓度，-20 ℃保存备用。

1.3 引物筛选及ISSR-PCR扩增

采用哥伦比亚大学公布的ISSR引物作为PCR扩增引物。优化后确定ISSR-PCR反应体系(20 μL)：1 μL的DNA，1 μL ISSR引物，8 μL ddH2O，10 μL Buffer；PCR反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，在55 ℃下，退火45 s，72 ℃延伸90 s，共36个循环，72 ℃总延伸420 s，4 ℃保存[9]。用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物，凝胶成像系统成像，从中选出扩增条带清晰、数量多、条带质量高的引物用于27种栎属树种遗传多样性检测。

1.4 数据统计与分析

根据ISSR-PCR扩增出的图谱，人工进行比对，可清晰辨认出的条带记为“1”，没有条带或者条带不清晰的记为“0”，建立数据库；数据利用PopGen 32 统计分析软件进行分析计算，聚类分析通过 Mega 6 软件进行。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

经过1%的琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行检测，结果显示，各个泳道的条带清晰明亮，无拖带及受到RNA、蛋白质污染的情况。紫外分光光度法测得所有样品的DNA浓度为40～200 ng·μL-1，A260/A280在0.77～2.09之间。

2.2 ISSR-PCR扩增多态性

从100条引物中筛选出12条对27种栎属树种进行扩增，得到12条扩增效果很好的引物(见表2)。12条引物共扩增出140个位点(部分引物扩增结果见图1)，其中有115个是多态位点，每个引物平均扩增了11.7个位点、9.6个多态位点，多态位点比率为82.14%,说明栎树遗传多样性较为丰富，环境适应能力较强。在这些引物中，引物UBC864扩增出的位点最多，有16个；引物UBC812的扩增仅为9个。多态位点比率最高是引物UBC835，为100%；最低是UBC825，仅为66.67%。

2.3 栎树的遗传多样性

利用PopGen 32软件计算27种栎属树种的遗传多样性，结果见表3，在27种材料中，多态位点比率为82.14%，但各类群间多态位点比率差异较大。Ⅰ类群的多态位点数为31个，多态位点比率为22.14%；Ⅱ类群的最低，有27个，多态位点比率为19.29%；Ⅲ类群的多态位点数最多，有97个，多态位点比率为69.29%，表明Ⅲ类群与其它几个类群相比具有较高的遗传变异，基因交流较频繁，有较强的环境适应力；Ⅳ类群多态位点有39个，多态位点比率为27.86%。27种栎属树种的观测等位基因数(Na)为1.807 1，有效等位基因数(Ne)为1.368 8，Nei′s 基因多样性指数(H)为0.231 9，Shannon’s多样性指数(I)为0.362 1，这表明27种栎属树种具有较高的遗传多样性。

表2 ISSR引物扩增结果统计Tab.2 The statistic of ISSR amplification result引物编号引物序列熔解温度/℃退火温度/℃扩增总位点数多态位点数多态位点比率/%UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGT5051111090.91UBC811GAGAGAGAGAGAGAGAC525011981.82UBC812GAGAGAGAGAGAGAGAA52509777.78UBC825ACACACACACACACACT505012866.67UBC827ACACACACACACACACG5052121083.33UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC50511212100.00UBC836AGAGAGAGAGAGAGAGYA525111872.73UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT505011981.82UBC846CACACACACACACACART525211872.73UBC857CACACACACACACACART505312975.00UBC864ATGATGATGATGATGATG5053161593.75UBC880GGAGAGGAGAGGAGA5053121083.33总计14011582.14

表3 27种栎属树种的遗传多样性分析Tab.3 The genetic diversity parameters of 27 Quercus L.类群样本数N多态位点多态位点比率/%观测等位基因数Na有效等位基因数NeNei's基因多样性HShannon's多样性指数IⅠ23122.141.221 41.156 60.091 70.133 9Ⅱ22719.291.192 91.136 40.079 90.116 6Ⅲ209769.291.692 91.316 10.199 00.310 4Ⅳ23927.861.278 61.197 00.115 40.168 5Ⅴ1——————

2.4 聚类结果与亲缘关系分析

利用PopGen 32软件结合Mega 6软件对27种栎属树种进行聚类分析，可将其分为5大类群(见图2)，分别命名为Ⅰ(2种)、Ⅱ(2种)、Ⅲ、(20种)Ⅳ(2种)和Ⅴ(1种)类群，Ⅰ类群包含了短柄枹栎和白栎；Ⅱ类群为小叶栎和娜塔栎；Ⅲ类群较为复杂，包含了舒玛栎、针栎、柳叶栎、南方红栎、北美红栎、月桂叶栎、沼生栎、无柄栎、北方针栎、沼生红栎、大果栎、星毛栎、沼生栗栎、水栎、麻栎、加州白栎、蒙古栎、川滇高山栎、乌冈栎、椭圆果栎；Ⅳ类群为夏栎和弗吉尼亚栎；Ⅴ类群为栓皮栎。随后将这5大类群进行聚类，结果如图3所示，5个类群可以聚为两大类，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ类群聚在一起，Ⅴ类群单独聚为一类。

利用PopGen 32软件对27种栎属树种进行遗传一致度与遗传距离分析，27种栎属树种遗传一致度的变化范围在0.542 9～0.900 0之间，遗传距离在0.105 4～0.610 9之间，其中红栎组中的北美红栎与月桂叶栎的遗传一致度最高，为0.900 0，两者之间的亲缘关系相对较近；栓皮栎和椭圆果栎遗传一致度最低，为0.542 9，两者之间的亲缘关系相对较远。

3 讨论

3.1 栎属树种的亲缘关系

近年来，随着分子生物学的发展，分子标记技术被广泛应用于各种植物遗传多样性、指纹图谱构建、亲缘关系等方面。在栎树方面，有研究运用SSR对栎属近缘种进行指纹图谱构建，并对其遗传结构进行分析，为栎属近缘种的鉴定及分类提供了重要依据[10]；Liu等[11]运用ISSR-PCR方法构建红锥、白锥、大叶栎的DNA指纹图谱，完善这3个树种的分子鉴定方面的研究。此外还有研究利用分子标记技术对白栎、辽东栎、栓皮栎及其近缘种进行遗传多样性分析[4，12-13]。

栎属因存在普遍的种间自然杂交，其属下分类一直存在争议。国外学者将栎属分为Sect.Cerris，Sect.Mesobalanus，Sect.Lepidobalanus，Sect.Macrobalanus，Sect.P rotobalanis和Sect.Erythrobalanus 6个组[14]。根据中国树木志将栎属分为槲栎组(即为白栎组)、红栎组、麻栎组、高山栎组和巴东栎组等[15]。《中国植物志》将中国栎属分为51种[16]，而有些学者则将一些分类地位模糊不清的种做了归并，认为只有35种。由图2可知，27种栎属树种聚分为5类，Ⅰ类群为短柄枹栎和白栎，两者亲缘关系较近，均属于白栎组。Ⅱ类群一个是小叶栎，属于麻栎组，一个为娜塔栎，属于红栎组，这组聚类与传统分类不一致。Ⅲ类群较为复杂，共有20个栎树品种，为红栎组、白栎组、巴东栎组等，其中绝大多数为红栎组，与传统分类不一致；其中，红栎组的北美红栎和月桂叶栎遗传一致度最高，为0.900 0，遗传距离为0.105 4，两者亲缘关系最为接近；栓皮栎和椭圆果栎遗传一致度最低，为0.542 9，遗传距离为0.610 9，两者之间的亲缘关系相对较远。南方红栎与柳叶栎亲缘关系较近。Ⅳ类群为弗吉尼亚栎与夏栎聚为一组，两者亲缘关系较近。Ⅴ类群只有栓皮栎，与其他类群之间的亲缘关系较远。在实际育种工作中，需要避免大量选择亲缘关系较近的材料作为亲本，这样有利于优良性状基因的组合。此外，栎属树种亲缘关系的远近并不一定与其来源相关，聚类分析中部分地理来源一致的材料聚在同一类，但也有一些地理来源不一致的材料聚在一类，并未完全按照来源地进行聚类分组，材料之间存在一定交叉，显示了复杂的亲缘关系。

3.2 下一步研究

为了建立更完善的栎属树种分类系统，今后需要进一步扩大样本采集范围与数量，并将ISSR分子标记试验结果与传统形态分类的研究结果相结合，为栎属树种的分类研究、育种亲本的选配提供参考。

我国具有丰富的栎属树种资源，其生态与经济价值不可估量，但在栎属树种遗传及育种方面的研究与国外存在一定差距，且栎属树种为风媒异交植物，自然杂交十分常见，其种间还可发生渐渗杂交。因此，栎属种间表现出十分复杂的形态特征，种间分类困难[17]。本研究利用ISSR分子标记技术可很好的区分27种栎属树种，并得出其多态位点百分率，遗传距离、遗传一致度等一系列数据，有助于进一步了解栎属树种的遗传基础，该技术也可应用到栎属新品种鉴定、杂交亲本的选配与新种质资源的划分等领域，应用前景广阔。

4 结论

本研究从100条引物中筛选出12条ISSR引物用于栎属树种的ISSR-PCR扩增，并且扩增出的条带丰富、清晰稳定、重复性好。12条ISSR引物能够将27种属树种扩增出140个位点，平均每条引物能产生11.7个位点。在扩增出的位点中，有115个是多态位点，多态位点比率为82.14%，并且12条引物扩增出的位点丰富、清晰稳定，表明栎属植物在进化的过程中具有较丰富的遗传变异，同时说明ISSR分子标记技术能够将他们区分开来。27种栎属树种中北美红栎与月桂叶栎的遗传一致度最高，为0.900 0；栓皮栎和椭圆果栎遗传一致度最低，为0.542 9。