李 松 ,陈伟祥,娄灯吉,杨亚丽

(1.玉溪师范学院 化学生物与环境学院,云南 玉溪 6531001;2.云南佳汇检测技术有限公司，云南 玉溪 653100)

玉米育种的重要参考之一是选择遗传多样性丰富的玉米种质.近年来，我国玉米育种的种质基础狭窄成为共识，种质遗传基础狭窄已经成为制约我国玉米育种持续发展的重要因素[1].这不仅会使我国的玉米育种遇到瓶颈，影响我国玉米育种的质量，还会由于某些病害的潜伏而造成严重的农业生产危害，使我国玉米生产质量下降.因此，我国许多玉米种质研究者都将视线转移到了地方品种上，因为我国的许多地方品种具有很多优良性状，如抗倒伏、抗干旱、抗病害、容易适应当地环境等[2].若能最大限度地运用这些地方玉米种质的优良性状，则可以有效地缓解目前玉米育种所遇到的瓶颈压力.通过反馈作用还可以增强现有玉米群体的遗传多样性，形成一个良性的循环.我国的地方种质普遍在山区保留，特别是贫困山区，了解该地方的种质遗传基础是有效对其利用的前提.

常用的遗传多样性研究的方法有：形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记[3].常用的分子标记包括限制性片段多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)、 扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、随机扩增多态性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、内部简单重复序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)[4，5].SSR与其他分子标记如SNP，AFLP等相比，具有以下优点：①简单重复序列在生物的基因组中随机的分布，且具有广泛的遗传变异位点，能检测到的多态性更高.②SSR标记是共显性标记，可以区分纯合子和杂合子，提供更全面的遗传信息.③微卫星序列的多态性可以用PCR技术检测，PCR技术简便，易掌握[6～8].随着生物技术的快速发展，利用分子标记技术进行玉米遗传多样性研究得到广泛运用.王凤格等[9]利用SSR标记分析328份玉米品种的遗传多样性及遗传分化特点，表明近年来育成品种遗传多样指数在不同年份间变化不大，除京津唐组之外在其他区试组间差异也不大；胡德分等[10]用筛选出的70对SSR引物分析19个云南常用自交系玉米，利用聚类分析可将云南19个自交系划分为4个类群，表明云南自交系遗传基础丰富，多态性好；杨荣志等[11]利用SSR分子标记技术分析川西高原早熟玉米遗传多样性，发现川西高海拔玉米种质资源相对独立，遗传多样性丰富.

本研究利用农业标准(NY/T1432-2014)[12]推荐的SSR核心引物，以云南昭通种植的14个玉米品种为研究材料，进行遗传多样性分析，阐述不同品种间的遗传距离，为云南昭通玉米种质资源的选育和推广提供理论和技术支持.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为云南省昭通市种植的14个玉米品种(表1).

表1 供试玉米品种

1.2 主要仪器及耗材

主要仪器：CT006248 PCR扩增仪(BIO-RAD)、Powerpac Universal垂直电泳仪(BIO-RAD)、D-37520台式冷冻离心机(Thermo)、TS-200摇床(QILINVEIER)、胶片观察灯、微量移液器(Thermo)、 AUTOCLAVE. GI54DW高压灭菌锅(ZEALWAY)、 PK-80恒温水浴锅(精宏)、 LFPM58-68生物安全柜(Thermo)

主要试剂：植物基因组DNA提取试剂盒(HP Plant DNA Kit)、PCR超混液(D331B)、6×Loading Buffer、琼脂糖、丰科公司的40%聚丙烯酰胺溶液、尿素、亲和硅烷、剥离硅烷、无水乙醇、四甲基乙二胺(TMED)、过硫酸铵、冰醋酸、硝酸银、甲醛、 DNA Marker、异丙醇、异戊醇、三羟甲基氨基甲烷等.

1.3 试验方法

样品DNA的提取：(参照Omega:HP Plant DNA kit操作方法)将14份玉米样品的种子参照植物基因组DNA提取试剂盒的方法提取各样品DNA，用50 μL TE溶液溶解后于-20℃储藏.

PCR扩增：DNA浓度调整至50 ng/μL，用于PCR扩增特异性产物.反应体系为25 μL：模板DNA 2 μL，正、反向引物10 pmol/μL各0.5 μL，Easy Taq Mix 12.5 μL，双蒸水9.5 μL.PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，35个循环，最后4℃保存.

琼脂糖凝胶电泳检测：在每个扩增样品中加入4 μL 6×Loading Buffer或自制Loading Buffer(含二甲苯青)混匀后，用浓度为2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测.

引物筛选：本试验分别用农业行业标准NY/T 1432-2014中推荐的40 对核心引物，用每种引物与14个样品的DNA模板进行PCR扩增后，根据琼脂糖凝胶电泳检测结果筛选出特异性条带.

6%聚丙烯凝胶电泳检测：将每个样品的PCR产物经95℃变性7 min后，4℃冷却15 min后，用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，电泳条件：电压1 500 V，电泳时间45 min.之后取出凝胶用去离子水漂洗10 s后放在10%冰醋酸中固定10 min，去离子水漂洗后在0.1% AgNO3溶液中染色10 min，再用去离子水漂洗后放置1%氢氧化钠和0.5%甲醛的显影液中，放置脱色摇床上至条带清晰后再次漂洗，观察结果.

1.4 数据统计与分析

本实验取带型清晰，按有或无记录，电泳条带有时记为“1”，否则记为“0”的原则，建立14个玉米品种的0-1指纹数据库.每个SSR位点的多态性信息量(Polymorphism information content，PIC) 按公式PIC=1-∑fi2计算，其中fi为i位点的等位基因频率[13].利用分析软件Popgene 1.32对筛选出的SSR引物的多态性、多态性指数(polymorphism information content，PIC)[14]、Nei’s遗传多样性指数和Shannon’s 信息指数(Shannon’s information index，I)[15]进行分析.将生成的数字化条带使用NTSYS 2.10e[16]软件计算不同品种之间遗传相似系数(GS,genetic similarity)，使用非加权配对平均法(UPGMA,unweighted pair-group method with arithmetic means)构建聚类图.

2 结果与分析

2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳

通过将PCR扩增产物变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳，引物扩增片段大小在150～450 bp，根据引物条带多态性和清晰度，筛选出18对SSR引物，如图1引物Phi072k4的扩增条带大小符合引物信息.

图1 引物Phi072k4对14份玉米材料扩增的SSR带型

2.2 引物的多态性分析

根据指纹图谱，18对SSR引物共检测到87个多态性片段，每对引物检测出的特异性多态片段分别为2～9个，引物Phi065k9和umc1492y13最少，检测到2个，bnlg161k8最多，检测到9个，平均每对引物可检测到4.8个多态性位点.由表2可以看出Nei’s遗传多样性指数变幅为0.133～0.463，平均为0.335，其中bnlg1940k7的遗传多样性指数最高，为0.463.Shannon 信息指数变化范围为0.257～0.655，平均为0.504，且Shannon 信息指数平均值均在0.5以上.18对引物的PIC变化范围为0.328～0.848，其中bnlg161k8的PIC最高为0.848，Phi065k9的PIC最低为0.328，平均为0.585.PIC与扩增的等位基因的数目和基因的频率有关，它能反映出SSR对品种的区分度，PIC平均值与材料的遗传基础丰富水平呈正关系[17，18]，当PIC≥0.5时，材料遗传基础为高度多态性；0.25≤PIC<0.5时为中度多态性；PIC<0.25时为低度多态性.本研究中，18对引物PIC平均值高于0.5，说明14份玉米品种的遗传基础丰富，呈高度多态性.

表2 18对SSR核心引物的多态性评估

2.3 遗传多样性分析

利用NTSYS 2.10e软件对14份玉米品种进行遗传相似性分析，遗传相似系数变幅为0.097～0.802，平均遗传相似系数为0.439(表3).大白玉9号与铜玉593遗传相似系数为0.802，其两者之间遗传相似性较高，遗传基础差异最小.而大白玉9号与西抗18的遗传相似系数最小，为0.097，遗传基础差异最大.

表3 14份玉米的遗传相似系数

2.4 聚类分析

基于遗传相似系数应用UPGMA对14种玉米进行遗传聚类分析.结果显示(图2)，以0.68为阀值可将14个品种分为五大类群，其中第Ⅰ类含2个品种，博玉19和昭黄11；第Ⅱ类含5个品种，罗单566、云大001、同玉213、大天44和大天183；第Ⅲ类有3个品种，金玉2号、大天006和同玉593；第Ⅳ类只含1个品种，贵单10号；第Ⅴ类包括3个品种，西抗18、大白玉9号和云优19.

图2 14个玉米品种的聚类分析

3 讨 论

种质资源是培育作物优质、高产的物质基础，是维系国家食物安全的重要保证，而种质资源遗传背景单一化会导致优良遗传资源的丢失.玉米种质资源的遗传多样性是进行玉米遗传改良的基础.SSR分子标记技术是近年发展较快和应用较广的研究种质资源遗传多样性的生物技术.李丽华等[19]利用62对SSR引物研究了135个西南地区玉米自交系的遗传多样性，结果说明云南地区的玉米与四川地区的玉米之间有相对较大的遗传多样性，也表明地理来源差异相对较大的材料遗传多样性相对较丰富.姚启伦等[20]利用SSR技术分别对来自云南和贵州的15个玉米地方品种群体进行遗传多样性分析，表明云南和贵州玉米地方品种存在较高的群体内遗传变异，且云南较贵州玉米地方品种的遗传变异程度更高.刘晓鑫[21]对中国玉米地方品种进行SSR标记检测，分析地方品种的遗传多样性，结果表明骨干自交系和西南山地玉米区的大部分群体结果单一，说明中国农家品种血缘的本土化.刘海忠等[22]为了拓宽玉米自交系的遗传基础，加快欧美优异种质的融入与利用，利用SSR分子标记对120份来自美国和塞尔维亚及2份中国的玉米自交系进行遗传多样性和聚类分析，结果表明美国NSS和塞尔维亚自交系群比美国SS和中国骨干系群遗传多样性高；美国NSS群与美国SS、塞尔维亚两个群之间的遗传一致度较高，表明美国与塞尔维亚自交系之间基因交流频繁，亲缘关系较近，为来自欧美自交系在玉米育种中合理利用提供可靠依据.昭通，位于云贵高原北部斜坡地带，云贵川三省结合部，地理及气候条件复杂.当地的玉米种质经过长期的自然选择形成了遗传多样性较丰富的山地玉米种质资源.

因此，本研究利用农业行业标准NY/T1432-2014中筛选的18对SSR引物对云南省昭通种植的14种玉米品种进行遗传多样性分析，共检测到87个多态性位点，平均每对引物可检测到4.8个多态性位点，多态性指数(PIC)为0.512～0.812，平均值为0.686，低于姚启伦等[20]云南的15个玉米地方品种的PIC值0.77，可能经过多年种植后，部分玉米种质资源本土化，遗传基础变窄，但呈高度多态性.遗传相似系数变幅为0.417～0.819，平均遗传相似系数为0.632，遗传差异明显，以0.65为阀值可将14个品种分为5大类群.根据不同的育种目标，以聚类分析结果为依据对地方玉米品种进行定向的改良和利用，可为昭通市玉米种质资源的选育和推广提供理论和技术支持，为今后的玉米育种工作中引进不同类型品种和不断提高云南省种质资源基础的丰富度、品质提供科学依据.