赵美纯 李 鑫 王 月 赵汉丞 赵冬雪 王盼盼 孙广玉,*

(1 东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150000；2 东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150000；3 东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150000)

东北黑土是我国珍贵的土壤资源，在确保国家粮食安全方面发挥着至关重要的作用[1]。近些年，受环境和人为等因素的影响，黑土旱田作物的单位面积产值下降，效益降低，因此农民将旱田改为收益较高的稻田(简称“旱改稻”)，黑土稻田种植面积大幅增加，提高了单位面积土地的效益。但这种土地利用类型的转变改变了土壤养分的利用途径，影响土壤中的生物活性和各种理化特性，也改变了土壤微生物群落功能的多样性，导致土壤肥力水平发生变化[2-4]。研究发现，“旱改稻”改变了黑土土壤微生物类群数量和土壤酶活性，其中土壤中真菌和放线菌数量在土壤改种后的前5年呈下降趋势，5年后则呈上升趋势[5]。且“旱改稻”的前3年土壤有机碳(soil organic carbon, SOC)和全氮含量均下降，4～25年则呈增加的趋势[6]。土壤团聚体作为土壤的基本结构单位，影响土壤微生物的分布与活性，土壤团聚体中的有机碳是土壤团聚体形成的重要胶结物质，已有研究发现，土地利用类型改变了土壤团聚体结构和土壤的稳定性[7-8]。不同粒径土壤团聚体的分布、大小和组成不同，影响了土壤团聚体内部空气和水分的分布，直接影响了土壤团聚体内微生物与环境间的物质和能量交换，导致土壤团聚体微生物的分布有较大的差异，也影响了团聚体中微生物群落结构不同[9-11]。

目前，国内外较多学者研究了“旱改稻”对耕层土土壤物理化学、土壤结构以及土壤养分等方面的影响[12-13]。但“旱改稻”对耕层土中土壤团聚体变化以及团聚体内土壤微生物功能水平等方面的研究却鲜见报道，关于“旱改稻”后黑土土壤团聚体内部的微生物群落结构和功能的关系，以及土壤团聚体内部对养分利用状况等尚不清楚。为此，本不采用Biolog-Eco微平板技术，研究“旱改稻”对土壤团聚体微生物群落多样性的影响，以期为东北黑土区土壤可持续利用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地位于黑龙江省哈尔滨市民主乡黑龙江省农业科学院试验田(45°49′N，126°50′E)，土壤类型为黑土。该区域属于温带大陆性季风气候，年平均气温3.1℃，七月平均气温20℃，年平均降水量569.1 mm，7—9月份西北季风降水量接近59%，无霜期150 d。

1.2 试验设计

以旱田玉米土壤为对照组，以旱田改种30年以上稻田土壤为处理组。在旱田和稻田分别布置3个方形区域(10 m×10 m)，于2017年4月在样地内采用“S”形布点法设置5个样点，分别采集旱田和稻田0～20 cm土层土壤样品，并将每个样地采集的5个样品混合均匀，取3次重复。剔除石块和根系残留后将土样装入无菌的封口袋中并用冰盒暂时存放带回实验室，4℃冰箱中保存。

1.3 测定项目与方法

土壤团聚体的分级采用湿筛法[14-15]。将采集的土壤样品打碎至<4 mm后，取50 g土样浸入一套装有去离子水(4℃)嵌套的筛子(250和53 μm)中，垂直震荡频率为25次·min-1。缓慢收集每个筛子上保留的团聚体，分别获得大团聚体(>250 μm)和微团聚体(53～250 μm)；剩余部分经5 000 r·min-1离心10 min后收集淤泥+粘土部分(<53 μm)。团聚体细分为：旱田大团聚体、旱田微团聚体、旱田淤泥+粘土、稻田大团聚体、稻田微团聚体和稻田淤泥+粘土6种。

团聚体内土壤有机碳(SOC)含量的测定采用重铬酸钾外容量-加热法[16]，由于黑土中不含有碳酸盐，因此土壤总碳即为SOC。土壤团聚体内总氮(total nitrogen，TN)含量的测定采用凯氏定氮法[16]。

土壤微生物群落功能多样性的测定采用Biolog-Eco平板技术[17]。Biolog-Eco平板含有31种碳源，根据碳源中碳水化合物官能团类型将31种碳源划分为六大类：胺类、氨基酸、羧酸、双亲化合物、聚合物和糖类，每个Biolog-Eco板有3次重复。称取4℃保存的烘干土约10 g，置于250 mL三角瓶中，加入90 mL去离子水，制成10%(m∶v)的土壤悬浮液，漩涡震荡1 min，冰浴1 min，重复3次。冰浴静置3 min后，转移至无菌操作台进行梯度操作：吸取2 mL悬液加入18 mL去离子水，在试管中混匀制成1%(m∶v)梯度的土悬液，同样的方法稀释至0.1%(m∶v)。将Biolog-Eco板预热至25℃，用8道排枪移液器吸取150 μL提取液至各孔中，对照孔加入150 μL无菌水。25℃恒温培养，分别于0、24、48、72、96、120、144、168、192、216和240 h时，用Sunrise酶标仪(瑞士TECAN)在590 nm波长处测定光度值。土壤微生物群落的平均颜色变化率(average well color development，AWCD)是反映土壤微生物代谢强度的重要指标；Shannon指数(H)用于评估微生物的丰富度；Simpson指数(D)用于评估优势度；McIntosh指数(U)用于评估基于群落物种多维空间上Eu-clidian距离的多样性[18-20]，均根据公式计算：

AWCD=∑(Ci-R)/n

(1)

H=-∑(PilnPi)

(2)

D=1-∑(Pi)2

(3)

(4)

式中，Ci为第i个碳源孔的光密度值；R为对照孔的光密度值；n为培养基的碳源种类数目，本研究中为31；Pi为有培养基的孔与对照孔的光密度值差与整板总差的比值；ni为第i孔的光密度值。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2010处理和作图，采用SPSS Statistics 17.0软件进行多重比较和主成分分析，采用Duncan新复极差法进行差异显著性检验，采用Person相关系数表示相关性。

2 结果与分析

2.1 “旱改稻”对土壤水稳性团聚体分布、团聚体内有机碳和总氮含量的影响

由表1可知，旱田和稻田中微团聚体(53～250 μm)所占比例最大，而大团聚体(>250 μm)所占比例最小。“旱改稻”后土壤微团聚体占比例超过50%，且显著高于旱田土壤，而大团聚体和淤泥+粘土(<53 μm)虽然略低于旱田，但差异未达到显著水平。

由图1可知，“旱改稻”明显影响了土壤团聚体内SOC和TN含量。与旱田相比，稻田土壤中的SOC含量显著增加(P<0.05)，但TN含量变化不显著(P>0.05)。旱田和稻田土壤团聚体内的SOC和TN含量均随着团聚体粒径的减小而降低，即大团聚体>微团聚体>淤泥+粘土。

注：不同大写字母表示旱田与稻田之间差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示3种团聚体粒径之间差异显著(P<0.05)。Note: Different capital letters indicate significant difference between the upland and paddy tillage at 0.05 level. Different lowercase letters indicate significant difference among particle size in three classes of isolated soil aggregate at 0.05 level.图1 旱田与稻田的不同粒径水稳性团聚体SOC和TN含量(n=3)Fig.1 The contents of SOC and TN in different particle size of all water-stable aggregates of upland and paddy tillage treatments (n=3)

表1 旱田与稻田的土壤水稳性团聚体粒径分布比例Table 1 Water-stable aggregate size distribution percentage of upland and paddy tillage /%

2.2 “旱改稻”对不同粒径土壤水稳性团聚体微生物平均颜色变化率的影响

注：UMAA：旱田大团聚体；UMIA：旱田微团聚体；USCF：旱田淤泥+粘土；PMAA：稻田大团聚体；PMIA：稻田微团聚体；PSCF：稻 田淤泥+粘土。下同。Note: UMAA: Macro-aggregates in upland . UMIA: Micro-aggregates in upland. USCF: Silt + clay aggregates in upland. PMAA: Macro-aggregates in paddy tillage. PMIA: Micro-aggregates in paddy tillage. PSCF: Silt + clay aggregates in paddy tillage. The same as following.图2 不同粒径土壤团聚体微生物群落AWCD随培养时间的变化Fig.2 Changes in AWCD of microbial community in particle size soil aggregates with cultural time

由图2可知，随着培养时间的延长，培养0～216 h过程中，旱田和稻田各粒径土壤团聚体微生物利用碳源的总量呈逐渐增加的趋势，且旱田和稻田不同粒径土壤团聚体微生物群落的AWCD增长幅度不同，说明各粒径土壤团聚体内微生物群落对碳源的利用能力存在差异，反映了各粒径土壤团聚体微生物群落组成的差异，这可能与土地种植作物改变，返还土壤中的养分不同有关。在培养24 h内，各粒径土壤水稳性团聚体微生物群落的AWCD无明显变化；培养24 h后，各粒径土壤团聚体微生物群落的AWCD快速提高，至培养96 h时，生长较缓慢的微生物均已参与碳源的代谢。与旱田相比，稻田土壤不同粒径团聚体中土壤微生物群落的AWCD在培养96 h时基本处于稳定，碳源利用能力达到相对稳定阶段用时较短，说明稻田土壤具有较高的碳螯合效率。在培养216～240 h期间，旱田大团聚体和微团聚体呈下降趋势，可能是因为没有足够碳源可以被各粒径团聚体中的微生物利用或者各粒径团聚体微生物对碳源的利用能力减弱。总体来看，旱田和稻田各粒径土壤团聚体微生物群落的AWCD变化幅度为：旱田淤泥+粘土>旱田大团聚体>旱田微团聚体>稻田大团聚体>稻田淤泥+粘土>稻田微团聚体，旱田团聚体微生物对碳源的利用程度均高于稻田，说明旱田团聚体微生物活性和物种丰富度高于稻田，且旱田和稻田中均以微团聚体微生物对碳源的利用能力最低。

2.3 “旱改稻”对土壤团聚体微生物群落利用碳源多样性指数的影响

表4 旱田与稻田土壤团聚体微生物对不同碳源的利用Table 4 Utilization of different carbon sources by soil microorganisms in soil aggregates in upland and paddy tillage

由图2可知，土壤微生物在培养96 h时，生长较缓慢的微生物均已参与碳源的代谢，因此选用此时的Shannon指数、McIntosh指数和Simpson指数分别用于评估微生物群落中物种的丰富度、优势度和均匀度，结果如表2所示。在旱田土壤团聚体微生物中，大团聚体微生物的Shannon指数和Simpson指数均低于淤泥+粘土微生物，而McIntosh指数高于淤泥+粘土微生物，而微团聚体中微生物的各指数均最低。在稻田土壤团聚体微生物中，大团聚体微生物的Shannon指数、McIntosh指数和Simpson指数均最高。通过双因素方差分析表明(表3)，土地利用类型和团聚体粒径极显著影响McIntosh指数；土地利用类型对Shannon指数和Simpson指数具有极显著影响，且稻田各粒径团聚体微生物的多样性指数均低于旱田相应粒径团聚体微生物。

表2 旱田与稻田土壤团聚体微生物AWCD与多样性指数Table 2 Microbial AWCD and diversity index in soil aggregates of upland and paddy tillage

表3 土地利用类型、团聚体粒径以及交互作用对McIntosh、Shannon和Simpson指数的影响Table 3 The effects of used land type, soil aggregates and their interaction on McIntosh、Shannon and Simpson index

2.4 “旱改稻”对土壤团聚体微生物利用6种碳源强度的影响

由表4可知，“旱改稻”降低了土壤团聚体微生物对氨基酸、羧酸、酚酸类化合物、多聚合化合物和碳水化合物的利用强度。在大团聚体中，旱田对氨基酸和碳水化合物的利用强度极显著高于稻田(P<0.01)，分别是稻田的1.30和14.16倍；在微团聚体中，旱田对氨基酸、羧酸、酚酸类化合物、多聚合化合物和碳水化合物的利用强度均极显著高于稻田(P<0.01)，分别是稻田的64.50、31.29、59.00、2.81和47.71倍；在淤泥+黏土中，旱田对氨基酸、酚酸类化合物、多聚合化合物和碳水化合物的利用强度均极显著高于稻田(P<0.01)，分别是稻田的304.5、7.08、4.21和83.67倍。

在旱田土壤团聚体中，大团聚体和淤泥+粘土微生物对氮基酸、羧酸和碳水化合物的利用强度高。微团聚体微生物对碳源的利用强度均最低。在稻田土壤团聚体中，大团聚体微生物对碳源的利用强度最高，其次为淤泥+粘土，微团聚体微生物对碳源利用程度最低。

对于胺类碳源，土壤微生物对其利用程度均接近为0，说明土壤微生物对此类碳源利用较少。

2.5 “旱改稻”对土壤团聚体微生物群落利用碳源主成分分析

主成分分析采用降维的方法，在31个因子中提取了3个主成分因子，分别解释所有变量方差的26.82%、20.35%和11.72%，主成分1和主成分2的累积贡献率达47.17%，是变异的主要来源，可以解释变量的绝大部分信息。由图3可知，旱田淤泥+粘土位于PC1的正端，稻田淤泥+粘土位于PC1的负端；旱田微团聚体多集中于PC2负端，稻田微团聚体多集中于PC2正端，说明旱田与稻田土壤团聚体微生物群落对碳源的利用具有一定差异。总体而言，旱田和稻田微生物的生理代谢功能差异明显，PC1与PC2基本上能够区分旱田和稻田各粒径土壤团聚体微生物群落的代谢特征。

图3 不同处理下土壤微生物群落利用碳源的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon utilization in soil microbial communities under different treatments

由表5可知，与PC1显著相关的碳源共16种，包括6种氨基酸、2种羧酸、2种酚酸类化合物、6种碳水化合物，说明这16种碳源导致旱田和稻田各粒径土壤团聚体微生物群落代谢功能多样性在PC1存在显著差异。与PC2显著相关的碳源有9种，包括1种胺类、1种氨基酸、4种羧酸、1种多聚合化合物、2种碳水化合物，说明这9种碳源导致旱田和稻田各粒径土壤团聚体微生物群落代谢功能多样性在PC2存在显著差异。

3 讨论

本研究结果表明，在土壤水稳性团聚体粒径分布比例中，“旱改稻”后大团聚体和淤泥+粘土含量均降低，但微团聚体含量却显著增加。大团聚体由易降解和水溶解态有机质来控制，在“旱改稻”过程中，由于土层结构被破坏，土粒间粘合力下降，大团聚体破碎为微团聚体，导致水稳性大团聚体分布比例降低[21]；而微团聚体是由多价阳离子桥和多糖形成，通过分子力与土壤颗粒表面的多价阳离子结合形成有机、无机复合体，然后与其他土壤颗粒粘结，形成稳定的微团聚体[21-22]。因此当土层被破坏后，多价阳离子凝聚，与作物根系上的多糖和粘粒间形成阳离子键桥，增加微团聚体粒径分布比例并增加微团聚体稳定性[22]；但由于淤泥+粘土的SOC和TN含量较低，没有足够的胶结物质和养分形成团聚体，使“旱改稻”后土壤淤泥+粘土分布比例降低[23]。本研究结果表明东北黑土团聚体可能以53～250 μm粒径的微团聚体为主。

旱田和稻田团聚体内SOC和TN含量均随着团聚体粒径的减小而降低。有研究表明，大团聚体主要由较低层次的团聚体与有机物质等胶结组成，大团聚体与小团聚体相比含有更多的SOC[24-25]。本研究结果显示，稻田中的SOC含量显著高于旱田，TN含量低于旱田，可能是由于“旱改稻”后，稻田土壤存在季节性淹水，稻田环境可以保护活性碳库不被快速分解，因此稻田SOC含量高于旱田[26]；但由于稻田作物固氮能力低于旱田作物，且稻田的季节性淹水导致土壤通气状况差，土壤硝化作用受到抑制，影响氮循环过程，因此稻田中TN含量低于旱田[27]。

表5 31种碳源与 PC1、PC2的相关系数Table 5 Correlation coefficients of 31 sole-carbon sources with PC1 and PC2

本研究旱田和稻田不同粒径土壤团聚体微生物利用碳源的总量在培养时间为0～216 h过程中呈逐渐增加趋势，表明土壤微生物群落代谢活性增强，培养216 h后进入稳定期。本研究微生物代谢活性进入稳定期的时间要长于张志浩等[28]和张志政等[29]研究，可能由研究区域气候条件不一致导致土壤微生物活性存在差异引起的；其次，由于黑土的自身环境，微生物种类更丰富，需要充足的时间进行培养，保证全部微生物利用碳源。随着培养时间的延长，旱田不同粒径土壤团聚体微生物利用碳源的总量均高于稻田，一方面可能由稻田的水分环境和厌氧环境导致[30-31]；另一方面可能是由于稻田存在季节性淹水，导致团聚体结构发生破坏，团聚体破碎后会形成较低层次的团聚体[32]，因此旱田和稻田不同粒径团聚体的含量和结构发生改变，影响了微生物对碳源的利用。

不同粒径土壤团聚体对六大类碳源的利用存在一定的差异，“旱改稻”导致土壤各粒径团聚体微生物对碳源的利用发生明显变化。其中，旱田团聚体微生物对碳水化合物、羧酸和氨基酸利用程度高，稻田团聚体微生物对多聚合化合物和羧酸利用程度高，说明“旱改稻”后减少了土壤团聚体中利用碳水化合物和氨基酸的微生物菌群。通过主成分分析进一步证明对PC1和PC2起分异作用的主要碳源为氨基酸、碳水化合物和羧酸。与旱田相比，稻田土壤微生物活性较低，且稻田土壤中的水坑常常破坏土壤结构，导致土壤团聚体对碳源的利用产生差异[33]；也有学者研究发现“旱改稻”降低了土壤的pH值，改变了土壤微生物群落，引起土壤中养分利用的变化，因此对碳源种类的利用出现差异[34-35]。

旱田不同粒径团聚体微生物的Shannon指数、McIntosh指数和Simpson指数均高于稻田，表明旱田土壤团聚体微生物群落物种数较丰富。其中通气状况与水分可能是影响微生物分布最主要的因子，“旱改稻”后土壤水分分布发生明显变化，土壤外部通气状态下降，阻碍了微生物的生长与繁殖，抑制了土壤养分的循环，导致稻田土壤团聚体中微生物的多样性指数较低[36-37]。在各粒径团聚体中，微团聚体群落多样性指数最低，对碳源的利用能力较弱，可能是由于微团聚体中含有较多高分子碳水化合物，微生物对其分解能力较弱，且微团聚体参与团聚体的形成作用大于参与养分循环的作用[38]。

4 结论

黑土“旱改稻”增加了土壤水稳性微团聚体比例，提高了土壤团聚体SOC的含量，降低了土壤各粒径团聚体内微生物群落的多样性，同时也降低了以氨基酸和碳水化合物为主的土壤微生物利用碳源的能力。为确保东北黑土可持续利用，后续可采用高通量测序技术研究“旱改稻”后土壤中难培养微生物种群变化，以进一步阐明“旱改稻”对土壤微生物群落结构及功能影响的生物学机制。