董世荣，蒋梦琪，孙宇,2*

(1.哈尔滨学院 食品工程学院，哈尔滨 150086；2.哈尔滨学院食品生物技术重点实验室，哈尔滨 150086)

玉米醇溶蛋白因为具有无毒、环保、生物可降解性、可食用性等特点被列为食品级材料[1]。玉米醇溶蛋白双亲特性赋予其形成胶体颗粒的能力。反溶剂法是制备玉米醇溶蛋白胶体颗粒的常用方法[2]。但天然玉米醇溶蛋白胶体颗粒稳定性差，为提高其稳定性，将天然甲壳素纳米纤维与玉米醇溶蛋白相互作用制备复合胶体颗粒，其稳定性较好[3]。海藻酸钠/壳聚糖与玉米醇溶蛋白复合形成的胶体颗粒具有较好的稳定性，是运载白藜芦醇的良好载体[4]。基于反溶剂法制备的酪蛋白酸钠-玉米醇溶蛋白复合胶体颗粒具有较好的稳定性[5]。超声处理小麦蛋白-壳聚糖复合胶体颗粒可以得到稳定性好的胶体颗粒[6]。

热处理是食品等行业常用的加工方法之一，因此也有研究集中在热修饰蛋白质改善其结构和性质。例如，Sun等[7]分别在不同温度下热处理玉米醇溶蛋白不同时间，热修饰的温度和时间影响了其二级结构、稳定性和形态。水浴、微波、射频3种处理方式在不同温度下修饰玉米醇溶蛋白均提高了玉米醇溶蛋白的溶解度、乳化能力和巯基含量[8]。在70 ℃短时间(15 min)玉米醇溶蛋白可引起初级结构变化[9]。但是这些研究更多的集中在短时间改变玉米醇溶蛋白的结构，或者通过复合活性较强的表面活性剂改善玉米醇溶蛋白胶体颗粒。

本研究在较高温度长时间加热处于弱极性环境下的玉米醇溶蛋白，旨在充分改变玉米醇溶蛋白的结构。即在70 ℃加热分散在80%乙醇-水溶液中的玉米醇溶蛋白10 h，然后利用反溶剂法制备胶体颗粒，旨在制备出较为理想的胶体颗粒。

1 材料与方法

1.1 材料

Z3625型玉米醇溶蛋白、ANS荧光探针 Sigma公司；透射电镜 日本日立公司；T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；F-4500荧光分光光度计 日本日立公司。

1.2 样品的制备

利用80%乙醇-水介质配制浓度为2.5%的玉米醇溶蛋白溶液，在70 ℃加热0 h和10 h。取2种溶液100 mL，分别边搅拌(1000 r/min)边缓慢分散至250 mL的去离子水中。用旋转蒸发仪将2种溶液中的乙醇去除，然后4000 r/min离心10 min，收集上清液。分别将加热0 h和10 h的玉米醇溶蛋白命名为天然玉米醇溶蛋白和热修饰玉米醇溶蛋白。

1.3 透射电镜的测定

利用去离子水将2种样品稀释成浓度为6 mg/mL，然后取一滴置于铜网支撑的碳沉积吸附膜上，吸附15 min，然后在室温下干燥20 min，利用透射电镜观测微观形态。

1.4 粒径的测定

将2种样品分别利用去离子水稀释成6 mg/mL，然后利用马尔文纳米粒度仪测定粒径大小和粒径体积分布，样品的测试在室温下进行。

1.5 表面疏水性的测定

利用0.01 mol/L磷酸缓冲液将2种样品稀释至0.015 mg/mL，加入20 μL 8 mmol/L的ANS荧光剂，旋涡振荡混匀，避光反应15 min。测定条件：激发波长390 nm，发射波长范围400～600 nm，激发和发射波长狭缝均设置为5 nm，测定样品表面疏水性的荧光光谱[10]。

1.6 游离巯基含量的测定

分布取300 μL浓度为10 mg/mL的2种样品加入到5 mL的8 mol/L尿素Tris-Gly缓冲溶液中，混合均匀后，然后加入20 μL的5,5′-二硫代双(2-硝基甲苯)试剂，旋涡振荡混匀，在室温下反应15 min，然后在412 nm波长下测定吸光值。空白样品调零，空白样品制备以300 μL去离子水代替等体积的蛋白质样品，其他均相同[11]。

1.7 内源性荧光光谱的测定

将2种样品利用去离子水稀释至6 mg/mL，稀释到合适的浓度激发波长为280 nm，发射光谱范围为290～450 nm，扫描速度为100 nm/min，激发和发射狭缝宽度均为10 nm，电压为700 mV，所有数据均在室温下收集[12]。

1.8 流变学特性的测定

利用马尔文流变仪测定,2种胶体颗粒的表观粘度。将反溶剂法制备的2种胶体颗粒利用旋转蒸发仪将浓度浓缩至5%，然后将样品分散液缓慢倾注充满夹具中(直径60 mm、锥角0.5o的锥板)，室温下测定。测定频率在0.1～100/s范围内样品的表观粘度[13]。

将反溶剂法制备的2种胶体颗粒利用旋转蒸发仪将浓度浓缩至5%，然后缓慢注满夹具(直径60 mm、锥角0.5°的锥板)，室温下保持5 min。采用0.3%振幅值，剪切频率0.1～10 Hz范围进行频率扫描试验，测定样品弹性模量(G′)和黏性模量(G″)随剪切频率的变化[14]。

2 结果与分析

2.1 反溶剂法制备的纳米颗粒的直观图和微观形态

图1 天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒图

玉米醇溶蛋白分散在80%乙醇-水溶液中，在70 ℃加热0 h和10 h，采用反溶剂法制备了天然和热修饰玉米醇溶蛋白2种胶体颗粒溶液，直观图见图1中A。反溶剂法制备的2种玉米醇溶蛋白胶体颗粒溶液均有部分玉米醇溶蛋白因为介质的变化迅速聚集，形成沉淀或者漂浮物，但是能够分散的胶体颗粒形成了均匀溶液。利用透射电镜观察2种胶体颗粒的微观形态，天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒微观形态分别见图1中B和C。天然玉米醇溶蛋白胶体颗粒呈现球状颗粒。Zhong等发现分散在55%～90%乙醇-水介质的玉米醇溶蛋白，利用反溶剂法制备胶体颗粒也呈现球状形态。高比例非极性氨基酸赋予玉米醇溶蛋白较强的表面疏水性，借助于改变介质极性促使玉米醇溶蛋白自组装形成球状胶体颗粒[15]。利用反溶剂法制备的热修饰玉米醇溶蛋白的胶体颗粒仍然为球状颗粒形态，说明加热并没有改变玉米醇溶蛋白形成球状颗粒的能力。

2.2 粒径的变化

2种胶体颗粒均呈现球状形态，但是粒径体积分布存在一定差异，见图2。

图2 天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒粒径体积分布

天然玉米醇溶蛋白胶体颗粒在粒径<1000 nm时，体积分布为7.98%；在1000～2000 nm范围时，体积分布为18.72%；在>2000 nm时粒径体积分布为73.30%；但热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒粒径体积分布发生变化，在粒径<1000 nm时，体积分布为5.15%，在1000～2000 nm范围时，体积分布为27.24%，>2000 nm时，粒径体积分布为67.61%。说明热修饰促使玉米醇溶蛋白形成的胶体颗粒更偏向于集中在粒径较小的范围。

2.3 表面疏水性

天然玉米醇溶蛋白胶体颗粒的表面疏水性与热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒的表面疏水性存在不同，见图3。

图3 天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒的表面疏水性

由图3可知，天然玉米醇溶蛋白胶体颗粒的表面疏水性大于热修饰后玉米醇溶蛋白的表面疏水性。反溶剂法制备玉米醇溶蛋白的胶体颗粒是改变介质环境从疏水环境变为亲水环境促使其自主装形成胶体颗粒。亲水的环境促进了玉米醇溶蛋白分子之间的聚集和有效地调控其自组装[16]。热修饰玉米醇溶蛋白具有较低的表面疏水性，对亲水环境有更强的适应性，进而形成颗粒更小。Tang等发现在95 ℃热修饰芸豆蛋白降低了其表面疏水性[17]。高温长时间加热增强了蛋白质之间的疏水相互聚集作用，这种聚合物具有较低的表面疏水性[18]。

2.4 游离巯基含量的影响

高温长时间加热蛋白质会促使蛋白质间或蛋白质内二硫键的形成。因此，测定了2种胶体颗粒游离巯基的含量，见图4。

图4 天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒游离巯基含量

天然玉米醇溶蛋白胶体颗粒游离巯基含量为9.54 μmol/L，热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒游离巯基含量为7.12 μmol/L。游离巯基和二硫键的含量影响着玉米醇溶蛋白的流变学特性[19,20]。

2.5 内源性荧光强度的变化

测定了激发波长280 nm时天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒内源性荧光光谱，见图5。

图5 天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒内源性荧光强度

内源性荧光光谱反映色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基团的暴露情况。加热增强了内源性荧光光谱的强度，这一结果与Sun等的研究结果一致。加热增加了玉米醇溶蛋白的荧光强度，可能是因为热修饰展开了玉米醇溶蛋白的结构，而色氨酸对蛋白质展开或折叠非常敏感，内源性荧光光谱变化反映蛋白质构象的改变[21]。

2.6 流变学特性的变化

利用弱极性介质环境(70%乙醇-水)溶解玉米醇溶蛋白配制成溶液后，在70 ℃加热10 h后玉米醇溶蛋白的弹性模量、黏性模量和表观粘度的变化见图6。

图6 天然和热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒流变学特性

天然玉米醇溶蛋白和热修饰玉米醇溶蛋白的弹性模量、黏性模量和表观粘度存在一定差异。在低扫描频率(<4.5 Hz)时，天然玉米醇溶蛋白的黏性模量大于热修饰玉米醇溶蛋白的黏性模量，当在高扫描频率(4.5～10 Hz)范围内，热修的玉米醇溶蛋白的黏性模量大于天然玉米醇溶蛋白的黏性模量(见图6中A)。在低扫描频率(<4 Hz)时，天然玉米醇溶蛋白的弹性模量小于热修饰玉米醇溶蛋白的弹性模量，当在高扫描频率(4～10 Hz)范围内，天然的玉米醇溶蛋白的弹性模量大于热修饰的玉米醇溶蛋白的弹性模量(见图6中B)。在低剪切速率(<50/s)时，热修饰玉米醇溶蛋白的表观粘度大于醇溶蛋白的表观粘度，当在高剪切速率(50～100/s)时，天然玉米醇溶蛋白的表观粘度略大于热修饰玉米醇溶蛋白的表观粘度(见图6中C)。流变学特性的差异可能源于热修饰带来的胶体颗粒大小、游离巯基和二硫键含量的不同[22]。

3 结论

基于反溶剂法制备的天然玉米醇溶蛋白胶体颗粒相比较，热修饰和天然玉米醇溶蛋白形成的胶体保持着球状形态，但热修饰玉米醇溶蛋白胶体颗粒更趋向于分布小粒径范围，具有更低的表面疏水性和游离巯基含量。热修饰改变了玉米醇溶蛋白的构象。2种胶体颗粒的流变学特性存在不同，主要是因为两者的游离巯基含量和颗粒大小不同。本研究旨在为制备运载调节风味的小分子物质的载体提供一定理论基础。