陈慧

[摘 要]利用学校微生物实验室和超净工作室的相关仪器设备，开设“微生物培养”选修课，带领高一学生通过设计大肠杆菌的培养分离实验来体验微生物培养的操作，建立相关课程的初步方案。利用有限的仪器设备和经费，让学生在课堂上充分参与了体验和实践，取得了良好的教学效果，建立了微生物培养的相关流程和操作规范，初步形成了较为完整的课程方案。

[关键词]大肠杆菌;微生物培养;选修课

[中图分类号]    G633.91        [文献标识码]    A        [文章编号]    1674-6058（2020）32-0088-02

高中生物选修模块一“微生物培养”体现了现代生物技术，是历年考试的热点。相关内容基于微生物理论知识和实验操作，传统教学通常采用理论讲授的方法，教学效果并不理想。学生从理论上记忆实验知识点和实验操作的易错点，是比较困难的，而且对实验过程和操作中出现错误的原因理解不到位，因此在考试中容易出错。通过动手进行实验操作，可以加深学生对相关原理的理解，使学生对实验操作错误原因有更多的直观体验。基于此，我校组建微生物实验室， 配备相关仪器设备，面向对生物理论知识和生物实验技术感兴趣的高一学生，开设了“微生物培养”选修课，尝试建立相关的课程方案。

一、课程目标

“微生物培养”是高中生物选修模块一中非常重要的一项内容，本课程通过设计大肠杆菌的培养实验来增强学生对微生物培养的直观体验，加深学生对培养基配制、大肠杆菌纯化等相关内容的理解和掌握，为学生今后学习相关内容打下坚实的实践基础。

二、 课程方案

1. 总体安排

面向学校全体高一学生开设“微生物培养”选修课。学生通过上网进行自主选课，由于超净工作室空间有限，实验配套设施有限，故只招收20位学生。每周开设1课时，总计10课时，地点选择在生物实验室三。课程采用理论教学和实际操作相结合的教学形式。课堂上着重让学生动手进行微生物培养的相关实验操作。全班学生分为4个组，每个组5名学生，在实验环节尽量让每个学生都进行实验操作。

2.实验方案

对实验器材进行高压蒸汽灭菌，配制固体、液体LB培养基，高压蒸汽灭菌后在超净工作台进行倒平板操作。实验过程中所用的大肠杆菌菌种为DH5α，使用平板划线分离的方法，将活性较低、储存时间较长的大肠杆菌进行活化和分离，对培养过夜后的大肠杆菌挑选单菌落进行扩大培养，最后对摇菌过夜的大肠杆菌使用30%的甘油进行菌种的冷冻保存。

3. 课时安排

本课程共设置10个课时：① 实验室仪器及超净工作室的认识; ② 培养皿、离心管、移液器枪头包装及高压蒸汽灭菌锅的使用; ③ 固体、液体LB培养基的配制及灭菌; ④倒平板操作;⑤ ～ ⑥ 大肠杆菌的划线分离; ⑦ ～ ⑧ 大腸杆菌的扩大培养;⑨ 对活化后的菌种进行甘油管藏法保存; ⑩ 各小组总结汇报实验成果。

三、实验材料及设备

实验材料：大肠杆菌DH5α、酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl、蒸馏水。

实验工具：药匙、称量纸、250 mL锥形瓶、培养皿、接种环、50 mL离心管、酒精灯、1.5 mL离心管、移液器。

实验设备：超净工作台、电子天平、高压蒸汽灭菌锅。

四、 实验结果和分析讨论

1.实验结果

（1） 固体与液体培养基的配制

实验过程中第一个重难点在于培养基的配制，由于高中课程一节课的时间为45分钟，而培养基需要配制好就进行灭菌，因而我们将培养基的制作分成两节课完成。培养基配制及灭菌放在一节课完成，倒平板放在下一次课完成。灭过菌的培养基可放入4 ℃的冰箱内进行保存。下一次课前提前将固体培养基进行加热，待固体熔化后再进行倒平板操作。LB培养基的配方如表1，固体培养基中须加入琼脂粉，液体培养基中无须加入琼脂粉，配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅，121 ℃高压灭菌20 min后4 ℃进行保存。

（2） 大肠杆菌的划线分离及结果分析

微生物接种纯化的方法有很多，由于课时的限制，我们选择了其中一种平板划线操作，通过接种环在固体培养基表面进行连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。先由教师对平板划线操作进行示范，之后再由学生进行操作。每位学生通过上节课的倒平板后，都至少有一块配制成功的平板。看过示范后，大部分学生都看懂了平板的划线分离法，但是到实际操作时，他们亲身体验的感觉又是很不一样的，如怎么托稳培养皿，怎么划线不会划破培养基的表面。做完后的学生都很兴奋，互相给后面的同学讲解经验。通过这样的方式，学生自然而然就知道操作过程中需要注意些什么。

大部分学生完成得都比较好，过夜培养之后实验结果比较理想，大肠杆菌的浓度随着划线分离出现了明显的稀释，平板上出现了较为清晰且饱满的大肠杆菌单菌落（如图1A）。也有部分学生实验失败，比如生长出了其他杂菌（如图1 B），或大肠杆菌没有培养成功（如图1 C），或是划线之后只出现了一组划线的大肠杆菌（如图1 D）。

这些可能是由错误实验操作或者无菌操作的技术不过关引起的。对于图1C和图1D出现的结果，学生进行了重点分析讨论，一致认为出现图1C的原因是接种环灼烧灭菌后未冷却温度过高导致的。而对于图1D的结果，学生认为有两个原因：一是第一次划线后灼烧接种环未冷却，二是第二个区域划线时接种环未接触到第一个区域划线的末端。通过实际的操作，学生对于自己的失败原因的讨论非常积极，很快就将结果总结了出来。

（3） 大肠杆菌的扩大培养

在超净工作台上，将37 ℃过夜培养之后的大肠杆菌固体培养基取出，挑选颗粒饱满、清晰的单菌落，用移液器枪头将单菌落的大肠杆菌接种到10 mL的液体LB培养基中，在37 ℃的摇床上过夜培养，培养完成后放入4 ℃进行保存。

（4）菌种的长期保存

配制100 mL 30%的甘油，高压蒸汽进行灭菌。将500 mL大肠杆菌菌液用移液枪转移到1.5 mL 的离心管中，以1∶1的比例跟30%的甘油混合均匀，做好标记后，放入冷藏箱中保存。

2.学生的参与过程

整个学期的实验过程中，学生的参与度很高，学习相关的实验原理，认真完成实验的操作，并对实验结果中出现的各种问题进行积极的思考与讨论，实现了预期的目标。对实验结果中出现的各种问题，学生通过讨论能够将可能的原因都回答出来，这比常规教学更能让学生对知识的学习融会贯通。有部分实验步骤的操作对于学生来说难度较大，可先由教师进行示范，再由学生进行实际操作，比如在平板上进行划线分离、对菌种进行扩大培养等。实验过程中还涉及很多培养过程，历时较长，由学生志愿者和教师在课后完成，比如划线分离后大肠杆菌的培养以及大肠杆菌的扩大培养，都需要过夜培养。

整个课程由于学校的大力支持，提供了很多仪器设备和课程经费，让学生在有限的课时内充分参与了微生物培养的实验操作，取得了良好的实验效果和教学效果，建立了微生物培养的相关流程和实验操作步骤，初步形成了比较完整的课程方案，实现了预期的教学目标。学生在进行实验时兴趣浓厚，通过亲身体验能够对实验操作的细节跟原理有更多的了解。通过无菌操作学生也初步感受到了生物实验的严谨操作，体会到了无菌技术对于微生物实验的重要性。当然，实验过程中还有很多需要改进的地方，比如学生操作的课程时间短，很多实验步骤来不及完成;超净工作台空间有限，一次只能两个学生同时进行操作，导致有些课时任务一节课无法完成;等等。这是学校首次开设“微生物培养”选修课，随着今后本课程的继续开展，实验过程和教学方案会得到进一步的完善。

[   參   考   文   献   ]

中华人民共和国教育部.普通高中生物学课程标准（2017年版）[S].北京：人民教育出版社，2018.

（责任编辑 黄春香）