何金莲

[摘 要] 丹参是我国重要的中药材，含有多种生物活性物质，可以治疗多种疾病。丹参人工种植难度大，而且易导致品种退化，利用组织培养技术的繁殖速度快、易脱除病菌和病毒等优点可以解决上述问题。基于此，本文总结丹参组织培养中选取外植体的方法、组织培养对培养基的要求、生长调节剂对出愈率和出芽率的影响、降低玻璃化率和褐化率的方法等，以供参考。

[关键词] 丹参;外植体;生长调节剂;玻璃化;褐化

[中图分类号] S567.53 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2020）28-91-2

丹参（Salvia miltiorrhiza Bge），为双子叶唇形科鼠尾草属植物，丹参干燥的根和茎常作为中药。丹参的主要含有丹参酮、丹酚酸等生物活性物质。丹参酮具有很高的医用价值，有抗菌、消炎、促进伤口愈合等作用，对冠心病、心绞痛等疾病有一定的疗效;丹酚酸B的抗氧化作用很强，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一，具有清除氧自由基、抑制脂类物质过氧化反应的作用[1]。丹参在治疗疾病方面发挥着巨大的作用，因而市场需求量很大。

近几年，野生丹参被过量开采但需求量日益增加，野生资源已无法满足人们的需求。丹参人工种植产量低，技术落后，只种不选的人工种植方式导致丹参品种退化严重。组织培养技术凭借繁殖周期短、易脱除病菌和病毒等优点得到了广泛应用，在提高天然药物品质和产量方面发挥了重要作用。推广应用组织培养技术是目前解决丹参种植困难等问题的有效途径。

1 外植体选择

在丹参组织培养中，一般选取幼嫩外植体，如根系、茎段、叶片，因为其增殖能力较强，可有效减少褐化和污染等问题[2]。房师梅等研究表明，根系和茎段更易形成愈伤组织，但是从茎段诱导出的愈伤组织质地较硬、数量较少、生长缓慢，易老化[3]。而且茎段为外植体时，分化速度较慢，一个月内仅萌发10%左右的腋芽和丛生芽，随着时间延长，丛生芽逐渐增多[4]。叶片作为外植体分化速度较快，7 d左右叶皱缩变厚，10 d左右分化出大量丛生芽。根的伤口诱导的愈伤组织质地松散、数量多、生长旺盛，松散型愈伤组织在初代培养和继代培养中生长较快。因此，用根作为外植体生长效果更好，其次是叶片。有研究表明，用根作为外植体可有效降低褐化率。

2 培养基选择

培养基是人工配制的、能满足植物生长发育需求的营养基质，筛选合适的培养基对培育优质丹参组培苗至关重要。丹参为典型的道地药材，不同产地的丹参对培养基的需求不同，蔡朝晖等研究发现同一丹参的不同部位对培养基的需求也不同[5]。应用最多的基本培养基是MS或1/2MS培养基，其营养丰富且全面，能满足组织生长所需的矿质营养需求，能加速愈伤组织生长。

培养基的pH值一般在5.5～6.0，多控制在5.7～5.8。pH值会影响培养基的凝固，培养基偏酸性时，培养基凝固效果较差。调节pH值的次数应最好控制在一次，过多会引入一些其他离子，增加其他离子的浓度，并影响离子的溶解度。

生长调节剂对组织培养愈伤组织的诱导、芽的发生等各个阶段起着重要的作用。例如，生长素2，4-D（二氯苯氧乙酸）可以强烈诱导丹参的愈伤组织，但对芽的形成有强烈的抑制作用，而且过量的2，4-D会产生毒害效应。2，4-D和细胞分裂素6-BA（6-苄基氨基嘌呤）搭配可使丹参茎、叶愈伤组织的诱导率最高[6]。周建国等研究表明，使用MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L培养基，愈伤组织诱导率可达95%[7]。客绍英等研究表明，使用MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養基，愈伤组织诱导率最高达98.3%[8]。生长素NAA（萘乙酸）对诱导愈伤组织也具有较强的作用，但不及2，4-D效果明显[9]，而6-BA和NAA的搭配使用可使芽增殖率升高，诱导出的根短且粗壮。已有研究表明，使用1/2MS+AgNO3 0.2 mg/L+6-BA 0.1 mg/L培养基，芽发生率达到85%[10]。孟倩等研究表明，使用MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基，生芽率可达98%[11]。赤霉素（GA、GA3等）可以促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。生长素吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）对根的分化都有很强的诱导作用，促进生根能力为NAA>IBA>IAA。仅添加激素IBA，就能取得很好的生根效果，1/2MS+IBA 0.5 mg/L，生根率最高达到100%[4]，IAA和NAA的搭配也有很好的生根效果，MS+IAA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L生根率最高为92%[6]。AgNO3在促进愈伤组织器官发生及体细胞胚胎发育方面也有很强的作用，并且可以在一定程度上克服玻璃化。

3 褐化抑制

褐化是指在多酚氧化酶催化下酚类化合物氧化成醌类物质，醌类物质会抑制其他酶类活性，对外植体或愈伤组织产生毒害，使细胞的正常代谢紊乱，甚至导致细胞死亡。影响褐化的因素较多，如基因型、外植体生长状况等。褐化类型不同，危害程度也不同。外植体规格、部位选择不当，均会导致褐化程度加深。褐化主要发生在初代培养及试管苗继代培养过程中。

常见的防褐化剂（抗氧化物质）有抗坏血酸（VC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）。焦金凤等研究表明，采用酒精进行外植体表面消毒，会加剧外植体褐化程度，而酒精灭菌时间短则褐化率降低，为8.89%[12]。外植体的幼嫩程度对褐化率有极显著影响，如木质化程度增加，褐化率加大[13]。低浓度的防褐化剂VC、PVP、Na2S2O3对抑制褐化有很好的效果。细胞分裂素及其浓度对褐化率有显著的影响。例如，6-BA浓度为1.0 mg/L时，可有效降低褐化率[14]。在培养中添加适量的活性炭可以有效降低褐化率。利用其吸附能力吸附培养物分泌的抑制物及琼脂中的杂质，减少一些有害物质的影响，可显著降低试管苗的褐化率并促进生根。但1 mg活性炭能吸附培养基中100 mg左右的生长调节物质，会削弱琼脂的凝固能力，因此添加活性炭的量不能太多。

4 玻璃化抑制

在组织培养过程中，嫩茎、叶片呈半透明水渍状的现象称为玻璃化。产生玻璃化的因素很多，如取材部位及外植体大小、培养基类型、植物激素等条件不适合，均可能引起玻璃化现象。出现玻璃化现象会使组培苗的增殖系数大幅度降低，诱导生根困难。细胞分裂素和生长素比例严重失调或细胞分裂素浓度过高，易产生玻璃化现象。KT（激动素）/NAA比例保持在3时，玻璃化现象缓解最明显。在培养基中加入活性炭，也可以显著降低玻璃化率[15]。培养基琼脂的浓度不合适也会产生玻璃化现象，适当提高琼脂的浓度，以增加培养基的硬度，可以缓解玻璃化现象[16]。

5 结语

丹参市场需求量越来越大，而丹参种植十分困难，迫切需要发展丹参组织培养技术。选择合适的外植体，合理配制培养基，抑制玻璃化、褐化，对丹参组织培养均有很大的影响。一般选取幼嫩外植体，其增殖能力较强，可减少褐化和污染等问题。低浓度防褐化剂对抑制褐化有很大的作用，活性炭能有效抑制玻璃化，但目前对抑制丹参玻璃化和褐化现象的研究还较少。丹参组织培养周期长、环节复杂，叶片和茎段作为外植体时褐化率和玻璃化率较高，目前的研究还无法用于工业生产，需进一步加强研究。

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