刘骁蒨，尤凡，尹航，马智超

变性梯度凝胶电泳技术在马属动物肠道微生物多样性研究中的应用＊

刘骁蒨，尤凡，尹航，马智超

（武汉商学院体育学院 国际马术学院，湖北 武汉 430056）

马属动物肠道微生物在马匹健康和性能方面都起着至关重要的作用。为了探究马属动物肠道微生物多样性，对变性梯度凝胶电泳技术在马属动物肠道微生物多样性和菌群结构方面的研究进展进行了概述，指出目前常用的分子生物学技术PCR-DGGE技术在分析动物肠道微生物多样性方面具有快速、精确等优点，表明PCR-DGGE技术是筛选优势菌株和分离有害菌等的有效手段，该技术为马属动物肠道微生物研究奠定了基础。

变性梯度凝胶电泳；马属动物；肠道微生物；菌群多样性

马属动物肠道内存在种类繁多的微生物，这些微生物和动物之间通过复杂的机制调节动物的消化吸收能力。因此，研究马属动物肠道微生物的结构，了解微生物和寄主以及微生物间的作用和功能，也为新功能菌株的发现利用提供理论基础，对维持马属动物健康和治疗相关疾病具有重要意义。用传统的方法培养微生物只能培养出一部分菌种，分析出的菌种种类受到限制，其反映出的微生物种类和群落并不准确。近年来，分子生物学技术快速发展，越来越多的新型仪器和手段被用于分析微生物多样性。其中变性梯度凝胶电泳技术具有检测率高、分辨率高等优点被迅速应用于马属动物肠道微生物的多样性研究中。

1 马属动物肠道微生物种类

马属动物肠道中存在着大量的微生物，微生物与宿主属于互利共生的关系，肠道中的优势厌氧菌主要有革兰氏阳性菌、梭菌等，其次还有链球菌、大肠杆菌、乳酸杆菌等[1]。乳酸杆菌是十二指肠中的优势菌群，而回肠中的优势菌群主要是大肠杆菌和链球菌。另外，厌氧纤维素菌群中瘤胃球菌属在小马胃肠中属于优势地位。动物肠道内的益生菌和肠道黏膜上皮特异性受体结合，形成重要的生物屏障，抵抗致病菌的侵蚀。益生菌在维护动物肠道健康和增强免疫力方面起着重要的作用。

2 马属动物肠道微生物的功能

2.1 提高免疫力

有研究证明，缺乏菌的动物肠道粘膜免疫及全身免疫系统都会出现异常，局部和全身淋巴系统也会出现缺陷。动物肠道免疫系统的建立和维持都离不开肠道微生物的存在。正因为有了肠道益生菌才能够维持免疫系统的正常运作，一旦肠道微生物群落遭到破坏就会提升机体炎症的发生率。

2.2 增加屏障作用

动物肠道屏障的构建物包括肠道内的物质，如微生物群落、代谢产物、黏液层、粘膜正常微生物菌群和定植抗力、粘膜上皮细胞等。动物肠道内的益生菌定植于肠道腔壁上，是肠道系统的一道强有力的物理屏障，对于动物肠道的健康保驾护航，同时对病原微生物起到了一定的排斥作用，并且对机体产生有益的刺激，促进抗菌物质的生成。

2.3 促进物质的消化吸收

马属动物肠道微生物直接影响着动物体内营养物质的消化和吸收。马属动物体内不同种类微生物都不断地发挥着各自的作用，它们能增加动物对小分子物质的吸收，促进动物对能量的吸收和利用。

3 PCR-DGGE技术概述

3.1 PCR-DGGE技术原理

基于聚合酶链反应（PCR）的变性梯度凝胶电泳（PCR- DGGE）是一种指纹图谱分析技术，其原理是利用不同序列的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其解链的温度不同，将其区分开来。扩增16S rDNA可变区的目的片段，得到等长的双链DNA片段，使其在变性凝胶中进行电泳，因为扩增到碱基对不同，其解链所需的聚丙烯酰胺浓度也不一样，进行电泳时，长度相同但碱基排列不同的DNA片段会停在凝胶的不同位置上，形成不同条带的图谱。理论上在精确的条件下（变性剂梯度、电泳时间、电压等合适），DGGE技术可区分仅有1个碱基区别的DNA片段。

3.2 PCR-DGGE操作方法

使用PCR-DGGE技术分析马属动物肠道微生物多样性的实验步骤有：首先是动物肠道内样本的采集，其次提取采集到的样本的总基因组DNA，接着使用 PCR方法扩增16S rRNA基因的目的片段，再将扩增到的目的片段进行聚丙烯凝胶电泳，随后取出凝胶用银离子染色及获得图片，将优势条带用刀切割下来进行回收，对凝胶电泳图使用相关软件进行数据分析。

提取核酸检测时，首先要提取肠道内样本中的DNA。学者研究提取总DNA的方法包括酶法、珠磨法及冻融研磨法等。通过比对，刘健华等[2]采用不同方法提取动物的粪便DGGE结果表明，酶法的裂解效果最差，而珠磨法提取粪便细菌核酸的效果最优。

用PCR的方法扩增细菌16S rDNA，利用细菌16S rDNA保守区序列高度一致的特点，设计扩增引物，扩增出不同的细菌菌群，然后再将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳PCR-DGGE，区分出不同碱基序列的细菌。

凝胶电泳后进行染色即显示出指纹图谱，目前常用的对凝胶进行染色方法是银染法。银染法的原理是先使银离子与核酸结合成复合物，再用还原剂将银离子还原，即黑褐色的条带出现在凝胶上。

根据遗传指纹，对图谱中条带使用软件进行分析，获得细菌群落的种群关系。电泳条带的数目反映细菌种类的多少，电泳条带的浓淡可以反映细菌的密度。对图谱分析时，常用的指标包括Shannon多样性参数，可对肠道微生物进行多样性进行分析。为获得进一步的信息，可使用种群专一性探针与得到的条带进行杂交或建立细菌16S rDNA文库或将条带切割扩增后测序，从而进行系统发育分析。

4 马属动物肠道微生物的研究

目前对于人类、反刍动物、家禽、猪等的肠道微生物已成为学者们的研究热点，但对于马属动物肠道微生物的研究并不多见。粪便作为马属动物肠道微生物研究的样本是切实有效的，并且新鲜粪便中有大量的微生物，但可培养细菌种群却不多。国内关于马肠道微生物的研究仅有为数不多的几个，如伊如格勒图[3]对蒙古马和纯血马肠道细菌多样性进行的研究，证明了马粪便中存在着大量的细菌微生物，且大部分是不可培养的未知菌种，具有宝贵的遗传学研究意义。邢振存[4]研究指出蒙古马和纯血马肠道内真菌种群结构丰富，且两种马匹优势真菌种群不完全一致，菌种几乎分别属于子囊菌门、担子菌门和新丽鞭毛菌门，以子囊菌门含量最多。蒙古马和纯血马共有菌属包括胃梨囊霉属、牛粪盘菌、细齿粪盘菌等。

DOUGAL等[5]对纯血马和矮种马的肠道微生物多样性进行研究后，结果显示同种动物大肠内微生物种群很接近，它们的优势菌群主要为厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体菌门、变形菌门和放线菌门。PROUDMAN等[6]通过对马匹肠道微生物种群结构的研究来判断马匹的肠道以及机体的健康状况。不同饲料对马匹肠道微生物种类的影响也不一样，FOMBELLE等[7]研究指出马属动物喂养不同的饲料后，其肠道微生物的菌群明显不同，饲喂大麦的马匹与饲喂干草的马匹相比，其盲肠和结肠中的厌氧菌，如乳酸杆菌和链球菌均显著增加，且肠道内纤维素分解菌的群落结构也不相同。

在患病马匹和健康马匹肠道微生物的研究中，COSTA等人[8]对6匹健康马匹与10匹患结肠炎马匹进行研究表明，利用细菌16S rDNA法获得的198 748条序列，结果表明健康的马厚壁菌门含量较高占到68%，其次是细菌占到14%。MORITA等[9]对日本一个马场饲养的马匹，使用PCR-DGGE技术检测了患有肠炎种马的胃肠道菌群多样性，研究结果显示，健康马匹的胃肠道大肠杆菌数量明显高于腹泻马匹排泄物中大肠杆菌数量，PCR-DGGE技术能够成为马属动物胃肠道群落结构研究的手段。

5 展望

PCR-DGGE技术是一种快速有效分析微生物多样性的技术手段，该手段是通过PCR扩增等长的目的片段，通过电泳区分不同碱基排列的条带，每个条带相当于一种微生物菌群，条带的明暗可以反映微生物群落的数量。它的优点在于PCR-DGGE技术可以获得不可培养的微生物多样性信息，可以分析到的微生物群落数量远远的超过了传统培养方法。目前，在微生物多样性的研究中PCR-DGGE技术已得到广泛应用，且将该方法与其他分子生物学手段联合使用，能够更全面地分析微生态等方面。近年来，越来越多的研究者也将PCR-DGGE技术应用于肠道微生物的研究上，但人们对马属动物肠道微生物的研究却相对较少。随着人们生活水平的提高，现代马业已成为了一种新型产业，而在养马的过程中，马属动物肠道的健康状况受到日益重视，采用PCR-DGGE技术开展马属动物肠道微生物相关研究，通过对其胃肠道内微生物多样性的测定以及研究饲料等因素对其肠道菌群多样性的影响，将为马属动物的饲养、疾病的治疗打下坚实基础。

［1］KRISTIAN D，COLIN S S，HARRY J F，et al.Bacterial diversity within the equine large intestine as revealed by molecular analysis of cloned 16S rRNA genes［J］.FEMS Microbiology Ecology，2001（38）：141-151.

［2］刘健华，陈杖榴，李云，等.肠道菌群多样性变性梯度凝胶电泳分析法的建立［J］.中国兽医科学，35（6）：445-449.

［3］伊如格勒图.蒙古马肠道细菌多样性的研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2015.

［4］邢振存.蒙古马和纯血马肠道真菌多样性初步研究及分析［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2016.

［5］DOUGAL K，DE LA FUENTE G，HARRIS P A，et al.Identification of a core bacterial community within the large intestine of the horse［J］. PloS one，2013，8（10）：e77660.

［6］PROUDMAN C J，HUNTER J O，DARBY A C，et al.Characterisation of the faecal metabolome and microbiome of Thoroughbred racehorses［J］.Equine Veterinary Journal，2015，47（5）：580-586.

［7］DE FOMBELLE A，JULLIAND V，DROGOUL C，et al.Feeding and microbial disorders in horses: 1-Effects of an abrupt incorporation of two levels of barley in a hay diet on microbial profile and activities［J］. Journal of Equine Veterinary Science，2001，21（9）：439-445.

［8］COSTA M C，ARROYO L G，Allen-Vercoe E，et al.Comparison of the fecal microbiota of healthy horses and horses with colitis by high throughput sequencing of the V3-V5 region of the 16S rRNA gene［J］.PloS one， 2012，7（7）.

［9］MORITA H，NAKAJIMA F，MURAKAMI M，et al.Molecular monitoring of the main changes in bacterial floral diversity in the gastrointestinal tract of a thoroughbred foal with catarrhal enteritis by using PCR-DGGE［J］.Journal of Equine Veterinary Science，2007，27（1）：14-19.

刘骁蒨（1983—），女，四川仁寿人，博士，讲师，研究方向为运动人体科学。

武汉商学院科学研究项目“速度赛马马匹肠道微生物多样性的研究”（编号：2014A011）

2095－6835（2020）10－0156－02

Q95

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.10.070

〔编辑：王霞〕