赵曾强，孙国清，2，吕 宁，孔 新，谢宗铭，李全胜，张国丽

（1新疆农垦科学院生物技术研究所，作物种质创新与基因资源利用兵团重点实验室，新疆 石河子 832003；2中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

0 引言

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌（Verticillium dahli⁃aeKleb.）引起的土传性维管束病害，该病原菌遗传多样性丰富[1]，寄主范围广，存活力强，严重阻碍该病害发生和防治的研究进展，且目前并没有有效的防治措施。不同生态条件下，特别是寄主和地区不同时，V.dahliae致病性变化很大[2，3]，其群体结构组成与变化直接影响着病害的发生与流行。近年来不同学者对棉花黄萎病菌的多样性进行了一些研究，但该群体结构一直处于动态变化之中，菌株变异频繁，强致病力菌株扩展迅速。因此，本文对棉花黄萎病菌遗传多样性及致病力分化进行综述，以期为棉花黄萎病菌的研究工作提供参考。

棉花黄萎病一般现蕾后开始发病，田间表现最多的为普通型，叶肉间出现不规则嵌状病斑，主脉仍保持绿色，呈掌状斑驳（“花西瓜皮”状）。有时夏季暴雨过后或浇水过后也会出现急性青萎型，多数或全株叶片萎蔫下垂，病叶似开水烫伤状萎蔫，并很快脱落呈光秆。秋季重病株下部叶片脱落，仅在顶端残留少量小叶或又发出新叶，蕾铃稀少，严重影响棉花的品质和产量[4，5]。

1 V.dahliae致病力及致病类型的分化

V.dahliae变异速度快、寄主范围广、品种抗性不一及生态环境的差异等，造成病原菌在形态、致病力等方面的分化。

根据培养特性，可将V.dahliae分为菌丝型、菌核型和中间型，且菌落类型与致病力具有一定的相关性，一般中间型致病力较弱或中等，菌核型致病力较强[6]。然而宋晓轩[7]在河南安阳发现严重落叶症状的菌系中存在菌丝型，其致病力是菌核型的两倍左右。韩宏伟等[8]对新疆不同地区的72个菌株进行形态学观察及致病性测定，其中菌丝型菌株共14株，弱致病力菌株5株，中等致病力6株，强致病力3株。因此菌丝型菌株也可能存在强、中、弱致病力的分化，还有待进一步研究。

根据症状可分为普通型、落叶型和枯死型。Schnathorst 和Mathre[9]首次根据V.dahliae在棉花上的致病力不同，将其分为落叶型（Defoliating，D）和非落叶型（Non-Defoliating，ND）两个类群。但仅凭症状不能确定病原菌是落叶型还是非落叶型菌系，这还与感病早晚及品种抗病性有密切关系。Pérez-Artés[10]设计特异性引物D1/D2 和ND1/ND2，可以从分子上将两种致病菌类型区别开来。新疆在1999年以前没有发现落叶型菌株[11]，且致病力普遍较弱；到2004年时发现有少量落叶型菌株[12]；到2008年检测时发现，落叶型菌株已占到待测菌株的40%[13]。说明棉花黄萎病菌群体结构一直处于动态变化之中，菌株变异频繁，强致病力菌株扩展迅速。

2 V.dahliae生理小种的划分

Bredikhina[14]首次将苏联棉花上的V.dahliae分为0、1、2 三个生理小种（表1）。其后，попов，якутиб，касьчненко 等[15]共鉴定出V. dahliae的8 个生理小种：0号小种V1V2V3，1号小种V1+V2V3+，2号小种V1V2+V3+，3号小种V1+V2+V3+，4号小种V1V2V3+，5号小种V1+V2V3+，6号小种V1V2+V3，7号小种V1+V2+V3（V+为毒性基因，V 为无毒性基因）。我国学者根据10个菌系在海岛棉、陆地棉和中棉三大棉种9 个棉花品种上的致病力不同，可将其划分为三个生理型[6]，但没有明确的生理小种划分：生理型I，致病力最强，陕西泾阳菌系为代表，对三大棉种都有严重感染；生理型II，致病力最弱，如新疆和田及车排子菌系，对三大棉种感染都很轻，但根据近年来的研究[11-13，16]和调查发现，新疆棉区强致病力菌株扩展迅速，截止2008 年时，中强以上致病力菌株已占待测菌株的80%以上；生理型III，致病力中等，如河南安阳、河北栾城和永年、辽宁辽阳、江苏丰县、四川南部和云南宾川等菌系。由于V.dahliae变异速度快、各地使用的鉴别寄主不一等原因，目前没有统一的划分标准。

另一种致病性分化（Pathogenic variation）的划分方法是将来源不同的V.dahliae群体分为两个生理小种，由效应基因Ave1的存在与否决定。Ave1对含有抗病基因Ve1的番茄或含有与Ve1同源抗病基因Vr1的莴苣是无毒的[17，18]。这些抗性基因在很多植物包括一些茄科植物中是保守的，生理小种1 侵染含有抗性基因Ve1或Ve1同源基因的植物，植物编码模式识别受体识别到小种1的毒性基因Ave1的编码产物就会触发防卫反应；相应地，缺乏Ve1抗性基因的番茄和拟南芥则对生理小种1 表现高度感病[19]。相反，生理小种2则不含效应基因Ave1，因此含有抗性基因的Ve1植物对其也表现感病[20，21]。生理小种2寄主范围广，遗传多样性丰富，在世界范围内广泛存在[22]。研究者利用引物对Tr1/Tr2和VdR2F/VdR2R可将来源不同的V. dahliae分为两个生理小种，其中检测的100 株来源于棉花上的菌株属于生理小种2[22]。

表1 前苏联棉花黄萎病生理小种划分[14]Table1 Cotton Verticillium wilt physiological division in Soviet Union[14]

3 营养亲和群研究

营养亲和群（Vegetative Compatibility Group，VCG）是指两菌株交融合并交换细胞质的遗传能力，传统上主要利用VCG 分析V. dahliae遗传多样性。Puhalla[23]首次利用nit 突变体技术对V.dahliae进行营养亲和型研究，将其划分为16 个营养体亲和群（VCGs）。随后Joaquim等[24]采用不能以硝酸钠为唯一氮源正常生长的nit 突变体亲和技术，将Puhalla所划分的16个VCGs重新划分成4个。利用VCG技术可将不同寄主和地理来源不同的V.dahliae分为5个 营 养 亲 和 群（VCG1，VCG2，VCG3，VCG4 和VCG6），后来又根据菌株互补的活力和频率分为不同的亚群（VCG1A 和VCG1B，VCG2A 和VCG2B，VCG4A和VCG2B）[24]。落叶型和非落叶型菌株属于不同的VCGs 类群，棉花黄萎病落叶型菌株属于VCG1A，非落叶型菌株在VCG2A 和VCG4B 都有存在[25]，VCG类群与致病力具有一定的相关性。

我国学者也对棉花黄萎病菌营养亲和群进行了大量研究。李延军等[26]利用nit 突变体技术首次对来自我国15个省（市）的66个分离菌株进行亲和性研究，将这些菌株分为两个类群，落叶型和非落叶型分别属于不同的类群。顾本康等[27]对江苏不同年代的100 个菌株进行亲和性测定，发现有6 株能与来自美国的落叶型T9产生亲和反应，属落叶型，其余均为非落叶型。吴献忠等[28]利用VD8、T9和Pu⁃halla的标准菌系做对照，对山东的代表菌株进行营养亲和性研究，将VD8、SD13、Puhalla的标准菌系和T9划分为一个亲和群，其他为另一亲和群。王克荣等[29]将来自全国不同年代的213 个供试菌株，划分为5个营养亲和群，其中Ⅰ群为落叶型，80年代保存的45 个菌株，只有2 个属落叶型菌系，而1997 年以后采集的168 个菌株中有163 个菌株为Ⅰ群，划在落叶型菌系内，表明落叶型菌株在江苏和黄河流域普遍存在。2000年时霍向东等[11]对来自新疆主要植棉区的30 个棉花黄萎病菌株和4 个对照标准菌株进行了致病性分化和营养亲和性研究，可将测定的34 个菌株分为两个类群，在新疆没有发现落叶型菌株。

4 分子生物学技术

V.dahliae的VCG 亲和群在群体遗传结构中可以代表一个独立的遗传群体，在分子水平上，不同的VCG 具有明显的DNA 多态性，在同一VCG 亲和群中也存在遗传多样性[30]。因此利用分子生物学技术能揭示更多的V.dahliae遗传多样性。限制酶切片段长度多态性（RFLP）、随机扩增片段多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单重复序列（SSR）及简单重复序列区间扩增（ISSR）等分子标记技术被用于鉴定病原种群的遗传多样性，研究病原种群的演变及种群基因水平转移等[31]。利用AFLP、RFLP 技术分析V. dahliae遗传多样性，聚类发现与VCG 亚群具高度的相关性[32]，无关地理和寄主来源，与致病力强弱也有一定的相关性，但RAPD有时会产生相反的结果[33]。例如，朱友勇、马峙英等[34，35]利用RAPD 技术对棉花黄萎病菌菌株进行聚类分析，发现聚类类群与致病群相关性不大，与地理来源有一定的相关性。

朱荷琴等[36，37]对我国不同省市的167 个黄萎病菌菌株进行致病力测定及基于SSR 和ISSR 的遗传多样性分析，结果显示SSR 聚类类群与菌株的致病力强弱没有相关性，与地理来源具有一定的相关性，而ISSR分析聚类类群与菌株的致病力存在明显的相关性，新疆菌系与内地菌系亲缘关系较远；可将菌株分为强、中、弱3 个致病类型，新疆菌株为弱致病力菌株。毛岚等[15]对我国20 个省市的棉花黄萎病病菌进行ISSR指纹图谱和营养亲和性鉴定，结果表明可将60 个供试菌株分为两个遗传群体和三个营养亲和型，遗传群体和地理来源具有一定的相关性，三个营养亲和型类群和致病力具有一定的相关性。ISSR可以揭示比RFLP，RAPD，SSR更多的多态性，操作简单，特异性强，实验稳定性较高。

5 存在的问题及展望

了解病原菌遗传多样性、群体结构组成、致病类型分化及分布情况是防治该病害的关键，是病害风险评估的前提，对指导抗病育种工作及合理布局抗病品种具有重要意义。V.dahliae寄主范围广、变异速度快及生态环境的差异等，造成病原菌在形态、致病力等方面的分化。但陆地棉抗病品种缺乏，且使用的鉴定品种不一等，使得棉花黄萎病菌仍然没有统一的生理小种划分标准。现代分子生物学技术日新月异，充分利用现代生物学技术研究V.dahliae遗传多样性及致病力分化，掌握病原菌种群群内基因变异程度，对棉花黄萎病菌种类鉴定、提高统防统治水平及现代分子育种具有重要意义。