许世超 傅孙丹 李长明

异位骨化（heterotopic ossification，HO）是指软组织出现成骨细胞并形成骨组织，大多发生在髋关节、肘关节等大关节周围，常继发于创伤、烧伤、神经损伤以及关节置换术后，是临床严重并发症[1]。临床常用非甾体类消炎药预防治疗HO[2]，但长期服用可引起消化道毒性、肾脏毒性等副作用[3]。本研究观察低强度脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs）对SD 大鼠HO 模型跟腱的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雄性SD 大鼠60 只，6～8 周龄，体质量（185.0±10.5）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[实验动物合格证号：SCXK（沪）17-0005]，由浙江中医药大学实验动物中心[SYXK（浙）2018-0012]饲养。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料及自由饮水，控制温度（23±2）℃和湿度60%，12h 循环灯光。实验操作均符合实验动物伦理学要求（伦理审批号：IACUC-20190909-26）。

1.2 药 物 水合氯醛（上海化学试剂采购供应五联化工厂，规格：250g，批号302-17-0RT）；吲哚美辛（石药集团河北永丰药业有限公司，规格：25mg，批号20150703），取吲哚美辛胶囊50mg 粉末混于100mL生理盐水，摇匀后制成0.5mg/mL 悬浮液。

1.3 主要试剂和仪器 Masson 三色染色液（北京利根生物技术有限公司，批号DC0032）；环氧合酶2（COX-2）Rb 抗 体（美 国Abcam 公 司，批 号Ab15191）；骨形态发生蛋白2（BMP-2）抗体（美国Abcam，批号Ab14933），辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（上海长岛，批号D-3004）；DAB（上海长岛，批号FL-6001）；苏木精（珠海BASO 公司，批号714094）；RIPA 缓冲液（北京阳光生物科技有限公司，批号R0010）；BCA 试剂盒（Thermo 公司，批号PICPI23223）；聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜（美国，Millipore，批号HATF00010）；5%脱脂牛奶（美国BD Biosciences，批号BYL40422）；抗COX-2（美国Abcam，1：500，批号Ab15191），BMP-2（美国Abcam，1：500，批号Ab14933）；GAPDH[美国Cell Signaling Technology（CST），1：1000，批号＃5174]。山羊抗兔HRP 标记的二抗（北京ZSGB-BIO，1：1000；批号ZB-2301） 化学发光试剂（美国Millipore，批号WBKLS0100）；ECL 成像系统（Tanon，中国上海，型号Tanon-5200）；脉冲电磁场发生器（湖南省永逸科技有限公司，型号亥姆霍兹线圈）；小动物X 光机（日本Toshiba 公司，型号M262105）；正置显微镜（日本NIKON 公司，型号ECLIPSE Ni），IMS 图像分析系统（日本NIKON 公司，型号DS-Ri2）。

2 实验方法

2.1 动物分组及造模 SD 大鼠60 只适应性饲养1周后按照随机数字表法分为空白手术组、HO 模型组、PEMFs 干预组、吲哚美辛干预组四组，各15 只。造模方法：所有大鼠腹膜内注射10%水合氯醛（0.2～0.3mL/100g）麻醉后，手术部位进行皮肤准备及碘伏消毒，于右后肢后外侧入路，暴露跟腱，空白手术组只暴露跟腱，不做其他处理，其余大鼠用血管钳反复钳夹跟腱5 次，其中跟腱中点处钳夹1 次，中点上下各钳夹两次造成相当程度创伤。然后在跟键中点处将跟腱完全切断，不予缝合。4 号丝线缝合皮肤，关闭切口。然后干预组给予干预处理。

2.2 干预方法 空白手术组和HO 模型组无需特殊处理。PEMFs 干预组：PEMFs 照射患肢，磁场强度2.5mT，频率10Hz，脉冲时间间隔15s，每次20min，1天2 次。吲哚美辛干预组：按10mg·kg-1·d-1剂量每天灌胃吲哚美辛混悬液4mL。两组疗程均12 周，常规分笼饲养。

2.3 各组大鼠一般情况及影像学观察 观察各组大鼠一般情况、伤口愈合及双后肢活动情况。术后4、12周所有大鼠经腹腔注射10%水合氯醛0.2～0.3mL/100g麻醉，釆用小动物X 光机，摄右后肢侧位X 线片，观察跟腱部位有无新骨形成。

2.4 跟腱标本取材以及组织学观察 术后12 周，采用空气栓塞法处死大鼠，切下完整的右跟腱组织以观察跟腱形态。组织学观察通过苏木精-伊红（HE）染色和Masson 染色进行。

HE 染色：取切下的完整右跟腱组织包埋并固定后，将组织切成4μm 切片，然后在65℃的烤箱中烘烤30min。将切片浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中15min，依次浸入100%、95%、85%和75%的乙醇中5min，再用自来水冲洗10min。之后，将切片在苏木精溶液中染色5min 后，在氨水中分色。流水冲洗15min，将切片依次在70%和90%的酒精中脱水10min，然后在1%曙红溶液中染色2min，进行酒精脱水。图片在显微镜上成像，使用IMS 图像分析系统分析。

Masson 染色：将上述切片脱蜡，韦格铁苏木精染色10min。用酸性乙醇分化溶液分化后，用Masson 蓝溶液将切片恢复为蓝色。之后，将切片用蒸馏水洗涤1min，并用力春红洋红色染色溶液染色5min，用弱酸工作溶液洗涤1min（蒸馏水：弱酸溶液＝2：1），再用弱酸工作溶液洗涤2min。磷钼酸溶液。此后，将切片用苯胺蓝染色溶液染色2min，用弱酸工作溶液洗涤1min。将切片用无水乙醇脱水5s，3 次，二甲苯透明1min，3 次，用中性树胶封固。图片在显微镜上成像，使用IMS 图像分析系统进行分析。

2.5 免疫组织化学（IHC）检测 取切下的完整右跟腱组织包埋，固定并切成4μm 切片，在65℃的烤箱中烘烤30min。将切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脱蜡15min（上海国药），依次在100%、95%、85%和75%的乙醇中浸泡5min，再用自来水冲洗10min，在室温下于0.01mmol/L 柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）中提取抗原15min 后，将切片在湿盒中与0.3%H2O2 孵育10min，与COX-2Rb 抗体、BMP-2 孵育1h，与HRP标记的二抗孵育30min。DAB 染色后，将切片用苏木精染色3min，并用1%盐酸进行酒精分化，然后用自来水冲洗10min。最后，将切片烧烤，透明和封闭，通过立式显微镜成像，使用IMS 图像分析系统采用IHC 评分分析COX-2 和BMP-2 的表达。IHC 评分标准[4]：染色强度（无着色：0 分；浅黄色：1 分；棕黄色：2分；棕色：3 分）；阳性细胞百分比（0～5%：0 分；6%～25%：1 分；26%～50%：2 分；51%～75%：3 分；＞75%：4分）。上述两个分数的乘积表示COX-2 或BMP-2 的表达。

2.6 蛋白质印迹（Western blot）分析 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA 缓冲液提取跟腱组织总蛋白。用BCA 试剂盒定量后，将25μg 的蛋白质进行10%SDS-PAGE 分离，并通过半干转移将其转移到PVDF 膜上。在室温下，用5%脱脂牛奶封闭膜1h，4℃下 与 抗COX-2 （1：500）、BMP-2 （1：500）和GAPDH（1：1000）孵育过夜。TBST 洗涤6 次，将膜在山羊抗兔HRP 标记的二抗（1：1000）中于37℃孵育1h。用化学发光试剂显影5min 后，将蛋白条带暴露在ECL 成像系统上。相对于GAPDH，用1.47v 版本的ImageJ 软件计算并分析COX-2 和BMP-2 的蛋白表达。

2.7 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（） 表示，采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况及影像学结果比较 各组大鼠术后切口愈合良好，术后右后肢活动减少，术后2周恢复正常。术后4、12 周，空白手术组大鼠均未见骨化，HO 模型组第4 周少量高密度影出现，提示异位骨的形成。术后12 周，HO 模型组大鼠骨化比第4周时更加成熟，骨化区域更大，亮度更高。PEMFs 干预组术后第4 周未见明显异位骨化，术后12 周与HO 模型组、吲哚美辛干预组相比骨化面积最小，X线表现密度影最低。吲哚美辛干预组术后4 周未见明显HO，术后12 周骨化面积、亮度均低于HO 模型组大鼠。结果表明血管钳反复钳夹跟腱的方法可以成功构建大鼠跟腱HO 模型，而干预组的干预措施可以减弱HO 的发生。见插页图1。

图1 各组大鼠后肢外侧X 线表现

图2 术后12 周各组大鼠跟腱组织学观察[图A（HE 200×） 图B（Masson 200×）]

3.2 各组大鼠手术跟腱组织学观察结果 术后12周，HE 染色发现HO 模型组跟腱结构被破坏，大量炎性细胞增殖并出现软骨细胞，而PEMFs 干预组和吲哚美辛干预组跟腱细胞肌腱排列整齐，无软骨细胞和骨组织（见图插页2A）。认为PEMFs 干预组和吲哚美辛干预组的干预措施显著抑制了炎性细胞的增殖和软骨细胞的形成。Masson 染色发现HO 模型组跟腱结构被破坏，Ⅰ型胶原在骨形成区域的软骨细胞周围增殖形成大量骨结构。而PEMFs 干预组和吲哚美辛干预组出现少量骨结构（见插页图2B）。认为PEMFs 干预组和吲哚美辛干预组的干预措施对Ⅰ型胶原的增殖具有明显的抑制作用。

3.3 各组大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 蛋白表达比较术后12 周，IHC、Western blot 检测结果显示，HO模型组跟腱COX-2、BMP-2 表达高于空白手术组（P＜0.01）。PEMFs 干预组、吲哚美辛干预组COX-2、BMP-2 表达低于HO 模型组（P＜0.05 或P＜0.01）。上述结果表明，PEMFs 干预组、吲哚美辛干预组干预措施可降低HO 模型大鼠跟腱COX-2 或BMP-2 的表达。见表1、图3。

表1 各组大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 阳性表达比较（分，）

表1 各组大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 阳性表达比较（分，）

注：空白手术组只暴露跟腱，不予钳夹跟腱；HO 模型组予钳夹跟腱；PEMFs 干预组予钳夹跟腱，PEMFs 照射患肢；吲哚美辛干预组予钳夹跟腱，灌胃吲哚美辛；PEMFs 为低强度脉冲电磁场；与空白手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

图3 各组大鼠跟腱Western blot 检测结果比较

4 讨论

通过血管钳反复钳夹跟腱的方法建立HO 模型是一种简单、快捷、成模率高、病理表现与人HO 产生相似的方法[5-6]。本研究显示，通过血管钳反复钳夹跟腱，HO 模型组大鼠术后4 周出现HO，12 周骨化面积显著增大；大鼠跟腱COX-2 和BMP-2 含量增多，考虑反复钳夹跟腱破坏了软组织的微环境，大量的炎性细胞增殖并出现软骨细胞，通过软骨化骨的方式形成HO[7]。可诱导的成骨前体细胞、刺激因子和诱导软组织骨化的局部微环境是HO 形成的三个基本条件[8-9]。目前临床应用最广泛且对预防HO 效果较为肯定的非甾体类药物主要是吲哚美辛，但用药的最佳时间、剂量及持续时间尚不明确[10-12]。并且应用吲哚美辛存在胃肠道不良反应、消化道出血以及骨不连的风险[13]。

PEMFs 可以增加疼痛和炎症区域的血流，改善局部血液循环及营养状态，促进渗出物的吸收与消散，产生消除肿胀、缓解或消除疼痛的作用，还能抑制炎症介质的致炎作用，增加通透性，促进水肿吸收，降低神经末梢反应性，对中枢神经有镇痛作用[14]。本研究显示，术后12 周，PEMFs 干预和吲哚美辛干预均显著抑制炎性细胞、Ⅰ型胶原的增殖和软骨细胞的形成。IHC、Western blot 结果显示，PEMFs 干预组、吲哚美辛干预组跟腱COX-2、BMP-2 表达低于HO 模型组。COX-2 主要参与病理条件下前列腺素（prostaglandin，PG）调控，并具有可持续转录和稳定表达的特征，在外部刺激下，COX-2 表达上调，诱导PG 合成，促进成骨细胞活性和骨形成[15]。细胞因子骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具有显著的诱导成骨能力，可能通过刺激间充质干细胞、成骨细胞的增殖与分化，和（或）通过刺激细胞外基质的合成与矿化等一系列过程来促进骨形成[16]。Lin 等[17]发现，HO 形成期间BMP-2、BMP-4 和BMP-7 显著升高。本研究显示，PEMFs 和吲哚美辛对HO的抑制作用无明显差异，可能通过阻断COX-2 和BMP-2 介导的信号传导通路，从而抑制HO 的产生。