周洋子，邱慧珍，董 莉，魏茹云，董爱菊，王友玲,王 川

(1.甘肃农业大学资源与环境学院/甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省畜禽废弃物资源化利用工程研究中心，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学动物医学学院，甘肃 兰州 730070)

由链霉菌(Streptomycesscabies)引起的马铃薯疮痂病是一种常见的土传病害，在世界各地马铃薯栽培区均有发生[1-2]。目前对这一病害最有效的防治方法是化学防治[3]，但大量使用化学药剂会造成土壤污染、降低土壤质量[4]、病原菌易产生抗性[5]等问题。生防菌中的芽孢杆菌，极易在环境中存活、定殖[6]，且具备环境友好、安全无毒等特点，是一类重要的植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)[7]，因此在农业生产上得到广泛应用，有效防控了黄瓜枯萎病[8]、香蕉枯萎病[9]、西瓜枯萎病[10]等作物的土传病害。

抗菌物质的分泌是芽孢杆菌重要的生防机制[11]。脂肽类化合物是芽孢杆菌产生的主要抑菌活性物质，包括表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和丰原素(Fengycin)3大类，不同种属的芽孢杆菌可产生不同或相同的抗菌物质[12-14]。我们前期从土壤中分离到5株芽孢杆菌对马铃薯黑痣病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)有很好的拮抗能力[15-17]，但其对链霉菌(Streptomycesscabies)引起的马铃薯疮痂病是否有拮抗作用尚不清晰，而且是否具有合成脂肽类化合物等抑菌活性物质的能力也未见报道。为此，本研究旨在从该5株菌中筛选出对马铃薯疮痂病原菌拮抗效果最佳的菌株，并对其生防机理进行初步探究，同时对筛选出效果最佳的菌株固态及液态发酵条件进行优化，以提高菌种生产量，为利用该菌株生产生物有机肥等应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 类芽孢杆菌(Paenibacillusjamilae)QHZ-1、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)QHZ-2、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)QHZ-3、莫海威芽孢杆菌(Bacillusaxarquiensisstrain)QHZ-4、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)QHZ-5由本实验室课题组分离、鉴定与保存[15-17]，

病原菌马铃薯疮痂链霉菌(Streptomycesscabies)由甘肃省农业科学院惠赠。

1.1.2 供试培养基 LB培养基、燕麦琼脂培养基、高氏1号培养基。

1.1.3 供试有机肥料 由江阴生物科技有限公司提供，有机质含量46.50 %，氮含量(N)1.41 %，磷含量(P2O5)3.25 %，钾含量(K2O )0.82 %。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 生防菌的拮抗效果 将病原链霉菌接种于燕麦琼脂培养基上，用无菌水冲洗孢子，4℃离心20 min，弃上清，用20%的甘油液重悬孢子，于-20℃保存备用。采用平板对峙法，取病原菌孢子悬液涂布于高氏1号培养基平板，并将已活化的待筛选菌种点接至培养基上，观察比较抑菌圈大小。

1.2.2 拮抗菌株的功能基因分析 本试验采用PCR对菌株基因组中脂肽抗生素合成相关基因进行检测。采用的引物是以菌株SQR9的相应基因序列为模板[18]，通过软件Primer Premier 5设计而来，另一部分引物序列见表1。将扩增产物进行检测纯化后，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。将得到的核苷酸序列在NCBI上进行BLAST比对，并进行功能基因的同源性分析。

表1 PCR扩增所需引物

1.2.3 发酵滤液的抑菌活性测定 采用牛津杯法测定抑菌活性。取100 μL病原菌孢子悬液涂布于高氏1号培养基平板，在培养基中间放置1个无菌牛津杯，加入菌株发酵滤液，于28℃黑暗培养4 d，观察抑菌圈的产生。

1.2.4 代谢抑菌物质对pH、紫外、温度的耐受性检测 酸碱耐受性检测：0.1 mol·L-1的盐酸与氢氧化钠调节无菌滤液pH值，pH值范围为3～11，保持1 h后调节pH为7.0，各取100 μL加入牛津杯，28℃黑暗培养4 d，记录抑菌圈大小。

热耐受性检测：将无菌滤液分别在20、40、60、80、100℃下保温20 min，冷却后各取100 μL加入牛津杯，28℃黑暗培养4 d，记录抑菌圈大小。

紫外耐受性检测：将无菌滤液放置紫外灯下 2、4、6、8 h，以不做处理的无菌滤液为对照，各取100 μL加入牛津杯，28℃黑暗培养4 d，记录抑菌圈大小。

1.2.5 液态发酵条件优化 液态发酵种子液的制备：将菌株在LB培养基上活化，挑单菌落于液体LB培养基中，培养菌液OD值达到2.0左右，作为种子液，此时菌体量约为108cfu·mL-1。

活菌数的测定:采用平板稀释法，将发酵菌液用无菌水稀释后各取50 μL，涂布于平板，3 d长出菌落后计数，公式为：

活菌数(cfu·mL-1)=菌落数/吸取量×稀释倍数

装液量优化试验：每250 mL的三角瓶中装液量分别为20、40、60、80、100、120 mL，将新鲜菌液按1%接种量，于37℃、170 r·min-1的条件下振荡培养24 h后，测其生长量，检测其对氧气的需求情况。

接种量优化试验：将新鲜菌液分别按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接种量，于装液量60 mL、37℃、170 r·min-1的条件下振荡培养24 h后，测其生长量，检测其最适接种量。

培养时间优化试验：将新鲜菌液按1%的接种量，于装液量60 mL、37℃、170 r·min-1的条件下，分别振荡培养24、36、48、60、72 h后，测其生长量，检测其最适培养时间。

转速优化试验：将新鲜菌液按1%的接种量，于37℃，装液量60 mL，转速分别为150、160、170、180、190 r·min-1的条件下振荡培养24 h后，测其生长量，检测其最适转速。

液态发酵条件正交优化试验：在以上单因素试验的基础上选取3个最适水平进行L9(34)正交试验。

1.2.6 二次固体发酵接种量的优化 取有机肥7 kg放置于周转箱(内径56 cm×36 cm×28 cm)，将氨基酸水解液(AA)按15 %(V/m )加入，搅拌混匀。定期取样测pH值，平衡7 d后备用。以液态发酵优化后的条件培养二次固体发酵的种子液，将QHZ-3-RFP菌株发酵液分别按1%、5 %、10%、15%(V/m)接入，每天翻堆1次，好氧发酵8 d。每天定时取样，采用平板计数法测定细菌数量(平板计数培养基：酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化钠10 g、卡那霉素100 μg·mL-1)。

1.3 数据处理

采用 SPSS 17.0对单因素试验结果进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比较，origin 2017 64Bit制图。

2 结果与分析

2.1 生防芽孢杆菌对马铃薯疮痂病病原菌的抑菌效果

从图1可以看出，5株生防菌中，除QHZ-4对马铃薯疮痂病病原菌没有明显抑制效果以外，其他4株菌对病原菌均有不同程度的抑制，其中QHZ-3的抑菌效果最佳，结合表2数据可得，抑菌圈直径达20 mm，抑菌率高达44.4%。

2.2 5株生防芽孢杆菌脂肽类抗生素合成基因检测

为了验证5株生防菌是否具有产生抗菌物质的能力，对5株菌中抗菌物质合成基因进行了测定，结果如图2所示。

图1 5株生防芽孢杆菌对马铃薯疮痂病病原菌的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of 5 biocontrol bacteria on potato scab pathogen

表2 5株生防芽孢杆菌对马铃薯疮痂病病原菌的拮抗作用

表2结果表明：所有菌株均扩增出与目的片段(535 bp)相同大小的条带。结合测序结果，我们可以确定所有菌株均具fengycin合成酶编码基因，序列比对结果表明，5株生防菌中的fen B基因与Bacillus subtilis fengycin合成酶基因(L42523.1)同源性分为98%、95.28%、95.34%、95.22%、95.22%。

针对抗菌物质Iturin，选择其调控基因itu A(616 bp)作为合成酶的代表基因进行扩增。检测结果如图3所示。

注：M为DNA 标记 DL2000。泳道1～5分别为菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板为ddH2O。下同。Note: M is DNA marker DL2000. Lanes 1-5 are strains QHZ-1, QHZ-2, QHZ-3, QHZ-4, and QHZ-5, respectively. CK template is ddH2O. The same below.图2 5株生防菌fen B功能基因的检测分析结果Fig.2 Detection of functional genes of fen B from 5strains of biocontrol bacteria

图3 5株生防菌itu A功能基因的检测分析结果Fig.3 Detection of functional genes of itu A from 5strains of biocontrol bacteria

QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5菌株扩增得到目的片段大小的明亮条带，QHZ-1、QHZ-2菌株中的itu A基因序列分别与B.atrophaeusUCMB-5137菌株的itu A基因(CP011802.1)同源性达到99%和97%，QHZ-3、QHZ-5与B.atrophaeus GQJK17菌株的itu A基因(CP022653.1)同源性达到99%。结合测序结果我们得知，QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5具iturin合成酶编码基因。

5株生防菌中，QHZ-3与QHZ-5扩增出与目的基因一致的明亮条带(图4)，测序结果与BacillussubtilisSurfactin合成酶基因(KC454625.1)同源性分别为97%和98%。因此， QHZ-3与QHZ-5具备Surfactin合成酶基因。

上述结果表明，5株生防菌中可检测到表面活性素Surfactin、伊枯草菌素 Iturin A、丰原素 Fengycin等合成酶基因，因此，5株生防菌株可能通过产生脂肽抗生素抑制病原菌的生长。

2.3 生防菌QHZ-3发酵滤液的抑菌活性测定

上述结果表明在5株生防菌中，QHZ-3对马铃薯疮痂病病原菌的拮抗效果最为显著，且该菌株存在抑制植物病原菌的3种脂肽类抗生素合成相关基因，推测该菌株可能同时具有抑制细菌性与真菌性病原菌活性的作用，为验证该菌株是否产生抑菌物质，我们测定其发酵滤液对病原菌的抑菌活性，见图5。

注：M, DNA 标记 DL2000；泳道1-5分别为菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板为ddH2O。Note: M, DNA marker DL2000; lanes 1-5 are strains QHZ-1, QHZ-2, QHZ-3, QHZ-4, and QHZ-5; CK template is ddH2O.图4 5株生防菌srf AA 功能基因的检测分析结果Fig.4 Detection of functional genes of srf AA from 5strains of biocontrol bacteria

图5 菌株QHZ-3无菌滤液对马铃薯疮痂病病原菌的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of QHZ-3 aseptic filtrateon potato scab pathogen

由图5可见，QHZ-3的发酵滤液对马铃薯疮痂病病原菌具有拮抗效果，抑菌圈直径达到30.4 mm，表明QHZ-3可通过产生抗菌物质抑制病原菌。生防菌在实际施用时，由于光照、温度、土壤酸碱度等条件的不同，会对生防菌的抑菌效果产生影响，故了解生防菌发酵液的抑菌稳定性可为生防菌在不同地区的应用提供理论依据。

2.4 菌株QHZ-3发酵液稳定性检测

生防菌QHZ-3发酵滤液经不同温度处理后的结果如图6所示。菌株QHZ-3的发酵液分别在20、40、60、80℃的温度条件下处理后，抑菌圈直径仍保持在30 mm以上，在100℃处理30 min后，抑菌率略有下降，但仍保持了一定的抑菌活性，表现了良好的热稳定性。

由图7可见，菌株QHZ-3的发酵滤液分别经紫外线照射2、4、6、8 h后，抑菌率低于CK处理，但抑菌活性没有完全丧失，且随着处理时间的增加，抑菌率没有明显变化，说明菌株QHZ-3发酵液对紫外光照有着较好的稳定性。

注: 不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。 Note: Different letters indicate that the difference between treatments is significant (P<0.05)，the same below.图6 菌株QHZ-3发酵液在不同处理温度下抗菌物的稳定性分析Fig.6 The stability analysis of antimicrobial substance infermentation broth of strain QHZ-3 at differenttreatment temperature

图7 不同紫外光照射时间下菌株QHZ-3发酵液抗菌物的稳定性分析Fig.7 The stability analysis of antimicrobial substanceof strain QHZ-3 at different UV irradiation time

不同pH条件下菌株QHZ-3的无菌发酵滤液对疮痂链霉菌的抑菌活性变化情况如图8。结果显示，在极酸和极碱的条件下，QHZ-3发酵液抑菌活性均一定程度的降低，但整体来看抑菌圈直径保持在27 mm以上，抑菌率无明显变化。

2.5 生防菌QHZ-3的发酵条件优化

以上结果可以看出QHZ-3及其无菌发酵滤液对病原菌有一定的抑制作用，且其代谢抑菌物质对紫外光线、不同酸碱度等均具一定的耐受性，可成为防治马铃薯疮痂病生物有机肥开发的潜质菌源，为此对该菌株液态及固态发酵条件进行优化，以提高其产量。

2.5.1 装液量对拮抗菌QHZ-3生长的影响 装液量与转速通过控制溶氧量来影响菌株生长[20]，装液量对QHZ-3生长的影响见图9。QHZ-3的生长量在一定装液量范围内随装液量的升高而增加，在60 mL生长状态最佳。当装液量超过80 mL时生长量极大程度下降，在装液量为120 mL时活菌数仅达到3.6×107cfu·mL-1。

图8 不同pH处理下菌株QHZ-3发酵液抗菌物的稳定性分析Fig.8 The stability analysis of antimicrobial substance ofstrain QHZ-3 treated with different pH

图9 不同装液量对QHZ-3菌株生长的影响Fig.9 Effects of different liquid loadings on thegrowth of strains QHZ-3

2.5.2 接种量对拮抗菌QHZ-3生长的影响 接种量指待接种的培养基与接种的种子液的体积百分比。接种量对菌株QHZ-3生长的影响如图10所示，随着接种量的增加，菌株的生长量呈现增加的趋势，在接种量为6%与8%时生长量达到最大，均可达到1.3×109cfu·mL-1，当接种量为10%时，菌体生长受阻，生长量降低，活菌数为5.3×108 cfu·mL-1。

2.5.3 转速对拮抗菌QHZ-3生长的影响 图11为转速对菌株QHZ-3生长的影响，随着转速的升高，菌株的生长量加大，在180 r·min-1时菌体生长量达到最大，活菌数为5.9×108cfu·mL-1。190 r·min-1后菌体生长量明显减少，降低到2.94×108cfu·mL-1。

2.5.4 培养时间对拮抗菌QHZ-3生长的影响 发酵时间对QHZ-3生长的影响见图12，在24～60 h内，菌体生长量与时间的增长呈正比，当时间增长到60 h时，菌体生长量最高，达到5.3×107cfu·mL-1。时间过久，菌体达到衰亡期，菌体生长量呈下降趋势。

图10 不同接种量对菌株QHZ-3生长的影响Fig.10 Effect of different inoculation amounton strain QHZ-3 growth

图11 不同转速对菌株QHZ-3生长的影响Fig.11 Effect of different rotational speedson strain QHZ-3 growth

2.5.5 液态条件的正交试验优化 为了确定液态发酵的最佳条件，在单因素试验的基础上，采用正交试验考察4种因素对QHZ-3生长的影响，正交试验因素水平表如表3所示。

根据上述单因素试验结果，各因素对 QHZ-3菌株生物量都有影响，正交试验的结果与分析见表4。

表4可见，影响菌株QHZ-3液态发酵的因素作用由大到小依次为摇床转速>发酵时间>装液量>接种量。结合各水平的最大K值，菌株QHZ-3的最佳液态发酵条件为装液量40/250 mL三角瓶、摇床转速170 r·min-1、接种量6%、发酵时间48 h，在此条件下，活菌数可达到1.31×1010cfu·mL-1。

表3 L9(34)正交试验因素水平表

图12 不同发酵时间对菌株生长的影响Fig.12 Effect of different fermentation time on strain growth

表4 L9(34)正交试验结果

2.6 二次固体发酵接种量对QHZ-3生长的影响

二次固体发酵中接种量对QHZ-3生长的影响结果如图13所示，在本试验条件下，接种量增加至10%时，活菌数已达到1.02×109cfu·mL-1，继续增加接种量至15%，菌体数量达到1.14×109cfu·mL-1，与10%的接种量无显著差异，且过高的接种量会增加成本。因此，选择10%作为种子液发酵最适接种量。

图13 二次固体发酵不同接种量对菌株QHZ-3生长的影响Fig.13 Effect of different inoculation amounton strain QHZ-3 growth

3 讨 论

在生防菌的不同拮抗机制中，产生抗菌物质是重要的方式。抑菌物质中表面活性素是最强的表面活性剂，有很强的杀细菌能力，而伊枯草菌素与丰原素则具备广泛的抑制丝状真菌和酵母生长的能力[21]，且这三者之间存在协同效应[22]。QHZ-3则具有编码这3种抗生素合成酶的基因，结合对峙试验的结果，我们认为萎缩芽孢杆菌QHZ-3为抑制马铃薯疮痂病效果最佳的生防菌株，且其发酵滤液对疮痂病原菌也具有抑制作用，代谢抑菌物质有较好的稳定性，推测抗菌脂肽物质的产生是其生防机制之一。

为了能够将该生防菌更好地应用到田间农业生产上，培养条件的优化必不可少[23-25]。

本研究将QHZ-3菌株的生长量作为主要考量指标，从培养环境对菌株发酵条件进行优化。研究发现，在发酵条件优化中，接种量对QHZ-3的生长有着显著的影响，过高的接种量会导致菌体之间黏性加大，产生过多的代谢废物而阻碍生长[26]。转速与装液量都是溶氧量影响菌株生长的体现，装液量或摇床转速过高，菌体获得的氧含量过低，阻碍菌体自生物质有氧降解，无法产出微生物正常生长所需要的能量。发酵时间对菌株生长的影响仅次于摇床转速，发酵时间过短，细菌在培养基中生长缓慢，导致发酵周期延长。发酵时间过长，菌株活力下降，引起菌体自溶，导致发酵菌体总量降低。

生物有机肥的发酵通常采用液-固两相的发酵方式进行，先通过液态发酵，快速培养大量高活力菌体，然后通过无菌输送将高活力菌体接种到固态培养基进行发酵[27]，这个过程中适宜的接种量非常重要[28]。本试验研究发现二次固体发酵中15%的接种量活菌数最高，但当接种量大于10%时，接种量对菌体数量的影响减少，且接种量过大会加速固态发酵培养基的消耗，使基质中溶氧不足或营养物质过度消耗，不利于菌落数的增加[29]。因此，考虑后期生物有机肥生产成本，选取10%为最佳接种量。

4 结 论

从供选的5株生防芽孢杆菌中，筛选出QHZ-3菌株，其对马铃薯疮痂病的拮抗效果最明显，能产生多种抗菌脂肽。针对QHZ-3菌株优化了其发酵条件，采用液-固两相发酵，在最佳发酵工艺条件下，即液态发酵装液量40 mL·250mL-1,摇床转速170 r·min-1,接种量6%，发酵时间48 h；二次固态发酵接种量为15%时，生物有机肥中QHZ-3的活菌数可达1.14×109cfu·mL-1。