张梦师 刘美珍 杨 斌

广西医科大学药学院，广西 南宁 530021

木棉花为木棉科植物木棉Gossampinusmalabarica(DC.) Merr.的干燥花,别名斑芝树、英雄花，攀枝花等。其性味：甘、淡，凉；归大肠经；具有清热利湿，解毒的功效[1]。药典记载，由木棉花、广木香、松石等组成的二十五味松石丸，可用于肝郁气滞，肝中毒，以及各种急、慢性肝炎等。伍小燕等[2-3]研究发现木棉花提取物能改善CCl4致大鼠肝纤维，缓解抗结核药物引起的肝损伤。本课题组前期研究也发现木棉花能降低CCL4和对乙酰氨基酚的AST、ALT值。表明木棉花具有潜在治疗肝损伤的作用，但木棉花发挥保肝作用的有效成分及其相关作用分子机制目前尚未有研究报道。

中药往往包含多种有效成分，其成分作用靶点、通路也并非单一。针对多成分，多作用靶点药物，网络药理学基于系统生物学和多向药理学为理论基础，通过构建药物-靶点-疾病之间的复杂网络来探讨药物的作用机制，利用专业网络分析软件及算法，可以系统的、整体的揭示药物疾病之间的联系[4-5]。为新药研发提供新途径和新策略。因此，本研究将借助网络药理学的技术与方法，对木棉花的主要成分及护肝的作用机制进行较全面和系统的分析，为进一步研究开发提供依据。

1 资料与方法

1.1 构建木棉花所含化合物数据库 利用中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP，https：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)检索“Gossampiniflos”获取得木棉花所含的所有化学成分，通过客观评价药物口服生物利用度与内在质量的重要指标的OB值(≥30%)和药动学特性与安全性的总和DL值(≥0.18)，筛选木棉花中可能的有效活性成分[6]。将上述活性成分以mol2格式保存各自的结构图。

1.2 药物靶点预测 登陆superpred webserwer和SwissTargetPrediction数据库，上传木棉花活性成分mol格式文件，其余设置按照条件设置。检索匹配得到药物的预测靶点，并对其不规范命名的靶点通过UniProt数据库进行规范化命名。将获得的木棉花活性成分和作用靶点的信息导入Cytoscape软件，构建木棉花“活性成分-作用靶点”网络图。浅蓝色矩形节点代表活性成分，红色圆形节点代表作用靶点，边代表活性成分和作用靶点之间的相互作用关系。

1.3 木棉花-肝损-潜在作用靶点预测 将木棉花药物检索的作用靶点与OMIM 数据库(http://omim.org/)搜集到的肝损伤靶点进行映射，比对分析，归纳总结获得木棉花治疗肝损伤作用的靶点。将映射后获得的木棉花与肝损伤相互作用靶点导入STRING数据库(https://stringdb.org/cgi/input.plsessionId=ieh6JADMAFtH&input_page_show_search=on)中获得靶点-靶点功能相关蛋白间的作用，并通过Cytoscape_v3.2.1构建木棉花-靶点-肝损PPI网络。

1.4 核心靶点生物功能和通路富集分析 应用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)对预测的相互作用靶点进行GO生物富集分析和KEGG通路注释分析，整理导入omicshare云平台(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/gogsea)对木棉花治疗肝损伤的主要靶点可能调节的生物过程及涉及的信号通路进行可视化，并根据P-value绘制生物过程和信号通路高级气泡图。

2 结果

2.1 木棉花活性化合物的筛选 通过 TCMSP 共收集到木棉花所含化合物93个。以OB≥30%和DL≥0.18 为筛选条件，有10个化合物符合条件，将其作为候选化合物见表1。

表1 10个候选化合物的化学信息

续表1

续表1

2.2 活性化合物靶点的预测 通过PharmMapper数据库检索到个木棉花验证靶点329个、预测靶点156个，swiss target prediction数据库检索到靶点150个。木棉花 “活性成分-作用靶点”网络如图1所示，该网络包含372 个节点和525条边。圆形节点代表作用靶点，边代表活性成分和作用靶点之间的相互作用关系。由表可知，同一活性成分对应不同的作用靶点，同一作用靶点也对应于不同的活性成分，表现出了木棉花多成分、多靶点的特点。

图1 成分靶点图

2.3 木棉花-肝损-潜在作用靶点预测 将木棉花有效化合物预测作用靶点与Drugbank数据库检索到的肝损伤靶点进行映射后获得20个木棉花治疗肝损的潜在作用靶点。分别是UGT1A9、GSR、CYP2E1、CA3、ABCB1、MMP2、CYP2A6、CYP2C9、CHRM3、CYP2A7、CYP2C19、ABCC1、PTGS2、FASN、SORD、NR1H3、NFE2L2、ENPP2、ABCC2、NOX4。如图2所示。

2.4 PPI网络构建 用STRING数据库中获得靶点-靶点功能相关蛋白间的作用，通Cytoscape_v3.2.1构建木棉花-靶点-肝损伤PPI网络。该网络共包含17个节点、41条边。其中，各节点表示靶标蛋白，每条边表示各靶标蛋白间的相互作用关系，边数越多表示该节点对应的靶标蛋白越重要。如图3所示。

图2 木棉花抗肝损伤靶点网络图

图3 木棉花-靶点-肝损伤PPI网络图

2.5 木棉花活性成分治疗肝损伤潜在靶点的通路注释 将预测出的 20 个作用靶点通过MAS3.0生物分子功能注释系统及omicshare云平台可视化分析，对获取靶点信息进行GO富集分析和KEGG通路注释分析。TOP10生物功能富集分析结果如图4所示，Heterocycle metabolic process，response to oxidative stress，response to drug，xenobiotic metabolic process，exogenous drug catabolic process，monoterpenoid metabolic process，steroid metabolic process，drug metabolic process，oxidation-reduction process，epoxygenase p450 pathway。这些生物过程主要与氧化应激、氧化还原过程、各种代谢的调控反应等的发生发展密不可分，意味着木棉花可能是通过调节以上生物过程发挥其抗肝损伤的作用。通过DAVID数据库及omicshare云平台可视化分析，TOP10信号通路富集分析结果如图4所示。结果表明，信号通路主要涉及pentose and glucuronate interconversions，serotonergic synapse，metabolic pathyways，retinol metabolism，ABC transporters，Linoleic acid metabolism，metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，Arachidonic acid metabolism，Drug metabolism-cytochrome p450，chemical carcinogenesis。表明木棉花抗肝损伤可能通过体内的相互转化、ABC转运蛋白、花生四烯酸代谢等通路发挥作用。

图4 生物功能和富集通路分析

3 讨论

肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负人体的重要生理功能，易受到体内外的各种刺激因子或致病因素的侵袭，引起损伤，不及时治疗控制，可以导致脂肪肝、肝硬化甚至肝癌[7]。大量研究表明中药及其有效成分可以通过抗氧自由基损伤、减少炎症的产生、改善肝功能等途径达到保护肝细胞治疗肝损伤的作用[8]。木棉花为木棉生长过程中产生大量的落花，地域分布广，资源丰富。木棉花始载于何克谏《生草药性备用》 “木棉花治痢症，白者更妙”，清代赵其光《本草求原》：“红者去赤痢，白者治白痢，同武彝茶煎常饮”，以木棉花作为组成的中成药被收录在药典及部版标准上[9-10]。木棉花巨大的资源和悠久的药用价值表明木棉花具有非常大的开发价值。既往研究及本课题组前期研究表明木棉花具有潜在治疗肝损伤的作用[2-3]。本研究应用中药系统药理学分析平台，利用STRING等软件和数据库研究化合物-靶点网络、木棉花-靶点-疾病之间的相互作用关系。

本研究发现槲皮素、橙皮素、3-甲基山奈酚、β-谷甾醇、菠菜甾醇、油酸乙酯等10个是木棉花的关键性有效成分。其中槲皮素、橙皮素、木樨草素、3-甲基山奈酚属于黄酮类化合物。大量研究[11-13]表明黄酮类化合物具有抗氧化、抗纤维化、抗炎、抑癌、抗病毒、抗衰老、抗抑郁和保护心血管、维持血糖稳定等药理作用。槲皮素可减轻肝炎、肝硬化所致的肝损伤，改善脂多糖诱导的L02细胞的炎性损伤[14]。橙皮素对肝脏单氧化酶系p450具有调节特有作用，由橙皮素能够显著提高免疫系统的效力，增加抗氧化剂的活性等[15]。β-谷甾醇、菠菜甾醇、豆甾醇为植物甾醇类化合物，研究表明具有抗炎、抗氧化、降血脂、调节免疫、抑癌等药理活性[16]。亚油酸乙酯据实验验证其对HepG2细胞均具有明显的保护作用[17]。表明这几个化合物可能是木棉花的潜在活性物质。

通过构建木棉花-靶点-肝损相关蛋白网络,发现多个相互作用的关键靶点PTGS2、CYP2E1、GSR、ABCB1、UGT1A9等20个。PTGS2基因是前列素环氧化物合成酶(PTGS)的一种亚型， PTGS2特异性抑制剂能抑制肝癌细胞增殖和诱导细胞凋亡[18-19]。细胞色素P450酶(CYP450)是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性物质和内源性物质的代谢中具有极其重要的作用[20]。CYP1A2、CYP2E1等是P450酶系的重要亚型，均能催化许多前毒物和前致癌物转化为有毒物和致癌物质，对肝脏产生危害，抑制 CYP1A2和CYP2E1的表达可拮抗CCL4产生的肝毒性[21, 22]。NOX是最早发现于吞噬细胞中的一种多亚基跨膜酶复合体，其主要利用 NADPH 将电子传递给氧分子，从而产生超氧自由基及活性氧。其中 NOX4 是 NOX 的催化性亚基中分布最广泛的一种[23-24]。在肝脏中，NOX4可参与四氯化碳诱导的肝星状细胞的增殖，促进肝脏纤维化等[25]。表明木棉花可能是通过上述预测的相互作用靶点发挥作用。

对关键靶点进行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，发现木棉花预测靶点富集在调节氧化应激、氧化还原过程、花生四烯酸代谢、P450酶系等各种代谢的调控、信号通路反应等方面功能。

本研究通过系统药理学的研究方法，对木棉花治疗肝损伤多成分、多靶标、多途径的复杂作用机制进行分析，结果表明木棉花有效化合物质槲皮素、β-谷甾醇、3-甲基山奈酚等可能通过氧化应激、氧化还原过程、花生四烯酸代谢、P450酶系代谢等信号通路等和作用于PTGS2、CYP2E1、GSR、ABCB1、UGT1A9等靶标蛋白进而发挥其改善肝脏损伤的作用，为中药木棉花的进一步开发利用提供理论参考。