唐芬芬，杨伟克

(1.红河学院 生命科学与技术学院，云南 蒙自 661101；2.云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)是一类广泛存在于生物体且相对保守的非特异性磷酸水解酶，它在碱性条件下不仅能催化磷酸酯的水解，生成无机磷及相应产物，而且参与了磷酸基团的转移和代谢[1-2]。ALP不仅在昆虫的生长发育、神经传导、物质代谢和滞育等过程发挥了重要作用，而且与昆虫的抗性密切相关[3]。有机磷处理云杉色卷蛾，其ALP基因表达量及酶活性会显著增加，虫体的抗性增强[4]。用菊酯类杀虫剂处理赤拟谷盗，ALP酶活性在处理24 h后显著增加[5-6]。棉铃虫ALP酶活性大小能够影响其对含有机磷农药的水解[7]。另外对除虫菊酯类杀虫剂具有抗性的棉铃虫品系，其ALP酶活性显著高于敏感品系[8]。

蜕皮激素20E能诱导昆虫发生蜕皮，保幼激素JH通过抑制蜕皮激素的作用以维持昆虫的生长状态[9-10]。两类激素的滴度在幼虫生长发育过程中交替上调，协同调控了昆虫的蜕皮与变态[11-12]。在对甜菜夜蛾的研究中发现，蜕皮激素20E能够激活马氏管ALP酶活性，而JH可以促进中肠和盲肠的ALP酶活性[13-14]。用JH处理雌性果蝇会降低ALP酶活性及多巴胺DA的含量，而20E处理能显著增加ALP酶活性及DA的含量[15]。

家蚕(Bombyxmori)作为一种重要的特种经济昆虫，饲育简单，蚕桑产业已成为我国农民提高经济收入的重要来源[16]。研究发现，质型多角体病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus，CPV)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)感染家蚕早期，ALP酶活性会增强，而感染后期，由于中肠组织受到一定程度的损伤，其ALP酶活性急剧降低，暗示ALP可能参与了家蚕的免疫防御过程[17-18]。ALP酶活性是衡量家蚕生理状况和经济价值的一项重要生化指数，激活ALP酶活性不仅能增强蚕体的抗逆性，而且有助于提高蚕丝产量和质量[19]。家蚕机体的ALP酶活性在每个龄期饷食后逐渐升高，盛食期最高，入眠时急剧降低[20]。食桑阶段，蚕体20E含量维持在一个较低的水平，而JH含量会逐渐增加；进入眠期，20E含量逐渐增加，JH含量降低，这暗示两类激素的变化规律与蚕体ALP酶活性变化规律存在一定的关联，而关于昆虫激素20E和JH对家蚕ALP酶活性的影响及其编码基因表达调控的研究相对较少。鉴于此，以鳞翅目模式昆虫家蚕为研究对象，探析昆虫激素对家蚕ALP基因的表达调控作用及对其ALP酶活性的影响，旨在为筛选和培育强健性多丝量家蚕新品种提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

供试家蚕品种为大造，饲育条件：恒温培养箱26 ℃，相对湿度(75±5)%，光照周期(12 h光照和12 h黑暗)，新鲜桑叶饲育。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 恒温培养箱购自广州深华生物技术有限公司；Tana 1220成像系统购自上海天能科技有限公司；普通PCR扩增仪和荧光定量PCR仪均购自美国ABI公司；Bio Tek Synergy多功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。

1.2.2 主要试剂 动物组织总RNA抽提试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)；荧光定量试剂SYBR Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)；蜕皮激素20E和保幼激素JH(Sigma公司)；BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime公司)；ALP酶活性测定试剂盒(南京建成生物有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 激素处理试验及样品采集 参考胡启豪等[21]的方法，用二甲基亚砜(DMSO)分别溶解保幼激素JH(质量浓度0.5 g/L)和蜕皮激素20E(质量浓度1.0 g/L)。选取家蚕五龄第3天发育良好的幼虫，用微量注射器在每头家蚕幼虫腹部分别注射4 μL的JH和20E，以注射等量的0.1% DMSO为对照组。在注射3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后，冰上解剖家蚕幼虫，取血淋巴和中肠组织，每次取样均设4次重复，每个重复取6头蚕，样品收集后置于-80 ℃保存备用。

1.3.2 酶活性测定 取适量家蚕血淋巴，在4 ℃条件下4 500 r/min离心15 min，收集上清液，即为待测酶液。家蚕中肠组织，用生理盐水清洗干净，置于玻璃匀浆器中匀浆5 min，4 ℃条件下3 500 r/min离心10 min，上清液即为待测酶液。按照BCA蛋白质测定试剂盒和ALP酶活性测定试剂盒说明书，分别测定蛋白质含量和酶活性。

1.3.3 总RNA的提取及反转录 根据动物组织总RNA抽提试剂盒操作说明，提取家蚕中肠和血淋巴总RNA，用分光光度计测定OD260/OD280的值，计算RNA样品浓度。取OD260/OD280在1.9～2.0的样品，按照反转录试剂盒操作将RNA反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR检测。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测 以真核翻译起始因子4A基因(家蚕芯片探针ID：Sw22934)为荧光定量内参基因，家蚕ALP基因(NCBI登录号：NM_001044071)为靶标基因，利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计定量引物。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

参照荧光定量试剂SYBR Green Master Mix操作说明进行实时荧光定量PCR。反应体系20 μL，扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；65 ℃ 5 s，(然后每次加0.5 ℃，直到95 ℃，5 s)。采用ABI公司StepOne荧光定量PCR扩增仪记录试验结果，每个样品均设4次重复，根据公式

2-△△CT计算基因的相对表达量。

1.4 数据处理及统计分析

采用Excel 2016进行数据处理及作图，数据均为平均值±标准差，利用SPSS 21.0进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 20E和JH对家蚕血淋巴和中肠ALP基因表达量的影响

实时荧光定量PCR检测了20E和JH处理后家蚕中肠和血淋巴ALP基因的相对表达量，将对照组ALP基因的相对表达量设定为1，处理组基因的相对表达量若大于1，表明该基因上调表达，若小于1则该基因下调表达，结果见图1。图1A结果表明，家蚕血淋巴的ALP基因在20E处理6 h、12 h和24 h均明显上调表达，其中在处理6 h表达量最高，约为处理组的2.3倍，而在处理3 h和48 h基因的相对表达量无明显变化，其相对值都是约等于1。中肠组织的ALP基因在3 h和6 h的相对表达量无变化，而在12 h和24 h显著上调表达，相对表达量分别为对照组的2.8倍和2.2倍，在48 h基因表达量减弱至对照组水平。图1B结果显示，JH处理家蚕后，血淋巴和中肠的ALP基因均呈现先逐渐上调表达，随着时间的延长，表达量增至最高值，随后急剧减弱至对照组水平。其中血淋巴的ALP基因在6～24 h持续上调表达，24 h表达量最高，约为对照组的3.7倍；而中肠的ALP基因从12 h才开始上调表达，在24 h相对表达量最高，约为对照组的4.7倍。

图1 20E(A)和JH(B)对家蚕血淋巴和中肠ALP表达的影响

2.2 20E处理对家蚕血淋巴和中肠ALP酶活性影响

用蜕皮激素20E处理五龄第3天家蚕幼虫，随着处理时间的推移，血淋巴和中肠的ALP酶活性变化趋势如图2所示。图2A结果显示，血淋巴的ALP酶活性在20E处理后的6 h、12 h和24 h均显著高于对照组，其中在12 h活性最高(为33.34 U/mg)，与对照组相比，达到极显著差异水平(P<0.01)。而中肠ALP酶活性仅在12 h和24 h极显著高于对照组(P<0.01)，其活性分别为37.68 U/mg和40.95 U/mg(图2B)。这表明20E对家蚕血淋巴和中肠ALP酶活性具有一定的促进作用。

与对照组相比,*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同Compared with the control group,* indicates significantly different (P<0.05) and ** indicates extremely significant (P<0.01),the same below

2.3 JH处理对家蚕血淋巴和中肠ALP酶活性影响

由图3结果可知，保幼激素JH处理家蚕幼虫，其血淋巴和中肠的ALP酶活性均是在6～24 h持续高于对照组，并且差异达到显著水平，整体呈现出先升高后减弱的趋势。其中血淋巴的ALP酶活性在6 h急剧增至最高值(42.29 U/mg)，随后开始逐渐减弱，在48 h酶活性接近对照组(图3A)。而中肠ALP酶活性从6 h开始逐渐增加，在12 h酶活性升至最高，为46.84 U/mg，在24 h酶活性开始有所降低，但仍极显著高于对照组(图3B)。

图3 JH处理后不同时间家蚕血淋巴(A)和中肠(B)ALP酶活性的变化

3 结论与讨论

ALP作为昆虫机体一类极其重要的水解酶，在对内源或外源化合物的解毒代谢和对杀虫剂的抗性形成中起着重要作用[22]。昆虫ALP随着机体发育时期及组织分布的不同，其活性大小也不相同[3]。家蚕血淋巴和中肠ALP酶活性在四龄盛食期活性较高，入眠时急剧降低，五龄起蚕酶活性逐渐升高，到盛食期活性出现峰值，此后开始减弱，熟蚕期维持一个相对较低的活性水平[20]。ALP参与蚕体营养物质的代谢吸收，影响蚕丝蛋白的合成及机体的抗性[19]。蜕皮激素20E和保幼激素JH是昆虫机体最为重要的两类激素，协同调控了昆虫的蜕皮变态及生长发育[23]。20E和JH对昆虫不同组织部位碱性磷酸活性的影响并不一致，20E仅能激活甜菜夜蛾马氏管的ALP酶活性，而JH对其中肠、盲肠和马氏管等组织均有激活作用[13-14]。

本研究结果显示，昆虫激素20E和JH均能诱导家蚕血淋巴和中肠ALP基因在一定的时间范围内出现上调表达，并且ALP的酶活性也显著高于对照组。血淋巴和中肠的ALP基因对20E和JH响应的时间存在一定的差异，其中血淋巴的ALP基因是在2种激素处理6 h开始上调表达，而中肠组织是在12 h出现上调表达。通过微量注射器在家蚕幼虫腹部注射20E或JH，激素最先进入血淋巴，并随着血淋巴的循环流动，被运送至蚕体其他部位，所以血淋巴ALP基因对激素的响应略早于中肠。另外，在激素注射的6～24 h，ALP及其编码基因受到外源激素的调控，而随着时间的延长，激素逐渐被消耗代谢，基因的表达及其酶活不再受其影响，逐渐恢复到对照组水平。JH和20E对家蚕ALP编码基因表达水平的影响与其对ALP酶活性的影响表现一致，提示ALP在家蚕蜕皮变态过程发挥了重要作用。20E或JH可通过作用于基因启动子区域相应的调控元件，进而调控相关基因的表达[24]，而ALP基因上游调控序列是否存在激素应答原件有待进一步深入探究。