刘 梦，魏玉磊，丁 冬，赵训超，罗伟毅，徐晶宇

(黑龙江八一农垦大学 农学院/黑龙江省现代农业栽培技术与作物种质改良重点实验室/黑龙江省秸秆资源化利用工程技术研究中心,黑龙江 大庆 163319)

脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)是一种含非血红素铁的脂肪酸双加氧酶，广泛分布于动物和植物中[1]。在植物中，LOX的基本底物是亚麻酸和亚油酸，根据在底物上的加氧位置，LOX大致可分为2个亚家族9-LOX和13-LOX[2]。研究表明，LOX是多功能酶，9-LOX亚家族基因在种子发育[3]、器官发育[4]、果实发育[5-6]中具有重要作用。13-LOX亚家族基因在植物发育及响应逆境胁迫(如病原侵染、虫害、盐和干旱胁迫等)中具有重要作用[7-9]。目前，已经在多种植物中进行了LOX基因家族全基因组鉴定，其中，大豆中有19个[10]，水稻、马铃薯和西红柿中均有14个[11-12]，苜蓿中有15个[12]，葡萄中有18个[12]，玉米中有13个[13]，拟南芥中则被鉴定出有6个LOX 基因，其中AtLOX2、AtLOX4和AtLOX6属于13-LOX亚族，AtLOX1和AtLOX5属于9-LOX亚族[14]。

高粱(SorghumbicolorL.)是非常重要的经济作物[15]，为禾本科高粱属一年生草本植物，是典型的喜温作物，对低温胁迫较敏感，尤其在萌发期和苗期[16]。目前，高粱中关于LOX全基因组鉴定及其应答低温胁迫的研究尚未见报道。为此，对高粱LOX家族基因进行全基因组鉴定，并对其进化关系、基因结构、保守基序、不同组织及低温胁迫下的表达模式等进行分析，以期为高粱LOX基因的功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 高粱LOX家族基因的鉴定及理化性质分析

将拟南芥中6个LOX蛋白序列作为种子序列，在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/)中进行BLASTP比对，获得同一性>90%且E值<10-10的所有高粱LOX家族成员的蛋白质序列。从http://pfam.xfam.org/网站上下载LOX结构域的HMM模型(PF01477和PF00305)，利用HMMER 3.0软件进一步对筛选出的蛋白质序列进行LOX结构域的查询,删除冗余序列，确认高粱LOX基因家族成员。

从NCBI数据库中获取LOX基因的编码区序列(CDS)和编码蛋白质序列等信息，查询染色体位置并利用Mapinspect绘制染色体定位图谱。在SIB生物信息学资源网站(http://expasy.org/)上确定分子质量和等电点。使用WOLF PSORT网站(https://wolfpsort.hgc.jp/)和(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)预测亚细胞定位。

1.2 高粱LOX家族基因系统进化分析

采用MAGE 7.0用邻接法(Neighbor-joining,NJ)对拟南芥、大豆和高粱LOX蛋白构建系统进化树，抽样次数(Bootstrap)设置为1 000次。

1.3 高粱LOX家族基因结构、保守基序(Motif)及二级结构预测

利用网站GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)预测高粱LOX基因结构；利用网站MEME(http://meme-suite.org/)预测高粱LOX基因保守基序；利用网站NPSA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)预测高粱LOX蛋白二级结构。

1.4 高粱LOX家族基因表达模式分析

高粱不同组织中LOX转录组测序数据来自Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/)，基因相对表达水平用FPKM值表示，利用Heml软件绘制热图。

1.5 低温处理高粱幼苗转录组学分析

选择高粱自交系冷敏感型材料黄壳子(S)及耐冷型材料平顶香(R)进行土培，待高粱生长至三叶一心时，将其放置于4 ℃低温培养箱中，分别于0、12、24、72 h进行取样，用于LOX基因表达量分析，通过转录组测序的方法获得基因相对表达量，基因相对表达量变化倍数用FC表示，基因相对表达量变化情况用Log2FC表示。

2 结果与分析

2.1 高粱LOX家族基因的鉴定、理化性质及染色体定位分析

经比对共鉴定出11个高粱LOX基因，根据其染色体位置命名为SbLOX1—SbLOX11。LOX基因CDS长度介于1 638(SbLOX10)～2 775 bp(SbLOX4、SbLOX8)；编码545(SbLOX10蛋白)～924(SbLOX4、SbLOX8蛋白)个氨基酸；编码蛋白质分子质量在61.61～103.71 ku；等电点平均值为6.98，其中，SbLOX1、SbLOX4、SbLOX10、SbLOX11等电点大于7.0，呈碱性，其余7个高粱LOX蛋白等电点小于7.0，呈酸性(表1)。

亚细胞定位预测结果显示，6个LOX蛋白定位于细胞质，分别为SbLOX1、SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6、SbLOX11；5个LOX蛋白定位于叶绿体，分别为SbLOX4、SbLOX7—SbLOX10(表1)。

表1 高粱LOX基因理化性质分析Tab.1 Physicochemical properties of LOX genes in sorghum

由图1可知，11个高粱LOX基因不均等分布于6条染色体上(1、3、4、6、7、8)。1号染色体上有4个，(SbLOX1—SbLOX4)，3号染色体上有2个(SbLOX5和SbLOX6)， 4号染色体上有1个(SbLOX7)，6号染色体上有1个(SbLOX8)，7号染色体上有1个(SbLOX9)，8号染色体上有2个(SbLOX10和SbLOX11)。

图1 高粱LOX家族基因在染色体上的分布Fig.1 Chromosomal distribution of LOX family genes in sorghum

2.2 高粱LOX基因家族成员系统进化分析

由图2可知，拟南芥、大豆、高粱LOX蛋白分为9-LOX和13-LOX两组，9-LOX亚族包括SbLOX1、SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6、SbLOX10、SbLOX11蛋白，其中SbLOX1、SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6与拟南芥AtLOX1、AtLOX5及大豆Gm10G153900.1、Gm03G237300.1具有较高同源性，SbLOX10、SbLOX11与大豆Gm03G091000.1有较高同源性；13-LOX亚族包括SbLOX4、SbLOX7、SbLOX8、SbLOX9蛋白，其中SbLOX7、SbLOX9与拟南芥AtLOX2及大豆Gm12G054700.1、Gm13G075900.1、Gm20G053700.1具有较高同源性， SbLOX4、SbLOX8与拟南芥AtLOX3、AtLOX4及大豆Gm07G039900.1、Gm19G263300.1同源性较高。

图2 拟南芥、大豆和高粱LOX蛋白进化关系Fig.2 Phylogenetic relationships of LOX proteins from Arabidopsis,soybean and sorghum

2.3 高粱LOX家族基因结构及蛋白保守基序分析

由图3可知，高粱LOX家族基因的外显子数目在4～9个，其中，SbLOX7基因外显子最少。9-LOX亚族中基因结构相似，外显子数目为6～9个，基因长度集中在6 kb以内；而13-LOX亚族中基因结构相差较大，外显子数目差异较大，在4(SbLOX7) ～9 个(SbLOX4)，基因长度也长短不一，SbLOX7最短，为4 kb，SbLOX9最长，为17 kb。

图3 高粱LOX家族基因结构分析Fig.3 LOX family genes structure in sorghum

由图4可知，在11个高粱LOX蛋白氨基酸序列中鉴定出10个保守基序。SbLOX10蛋白含有保守基序1、4、6、7、9、10；其余10个高粱LOX蛋白均含有保守基序1—10，且它们的排列顺序基本相同，表明高粱LOX家族蛋白的保守基序具有很高的保守性。

图4 高粱LOX蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motif analysis of LOX protein in sorghum

2.4 高粱LOX家族蛋白的结构预测

对高粱LOX蛋白二级结构进行预测(表2)发现，α-螺旋占28.99%～40.80%，无规则卷曲占35.11%～41.99%，延长链占13.85%～23.85%，β-折叠占7.14%～11.20%，可见高粱LOX蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。由图5可知，高粱9-LOX亚家族中SbLOX1、SbLOX2蛋白的二、三级结构相似，SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6蛋白的二、三级结构相似；13-LOX亚家族中SbLOX4和SbLOX8蛋白的二、三级结构相似。

表2 高粱LOX蛋白二级结构的氨基酸数目和比例Tab.2 Amino acid number and percentage of secondary structure of LOX proteins in sorghum

图5 高粱LOX蛋白二级结构(A)和三级结构(B)的预测Fig.5 Prediction of secondary structure(A)and tertiary structure(B)of LOX protein in sorghum

2.5 高粱LOX家族基因的表达分析

2.5.1 不同生长发育时期组织中的表达 由图6可知，9-LOX亚族中SbLOX10与13-LOX亚族中SbLOX9在高粱不同生长发育时期组织中的表达量均较低；9-LOX亚族中SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5与13-LOX亚族中SbLOX4、SbLOX8在高粱不同生长发育时期组织中的表达量均较高，9-LOX亚族中SbLOX5除幼苗期叶片及成熟期种子外在其他时期表达量均较高。总体上，9-LOX亚族基因在高粱各组织中的表达量均高于13-LOX亚族基因。

1：幼嫩期正生长的叶片；2：营养生长期下方卷叶；3：幼嫩期下方叶片;4：营养生长期中部卷叶;5：营养生长期上方卷叶;6：幼嫩期上方叶片;7：开花期下方处于生长状态的叶片；8：花蕾形成期下方处于生长状态的叶片；9：成熟期下方处于生长状态的叶片；10：开花期处于生长状态的叶鞘; 11：花蕾形成期处于生长状态的叶鞘;12：成熟期处于生长状态的叶鞘； 13：开花期上方处于生长状态的叶片；14：花蕾形成期上方处于生长状态的叶片；15：幼嫩期底层根系；16：营养生长期底层根系；17：幼嫩期表层根系； 18：营养生长期表层根系； 19：开花期底层根系； 20：花蕾形成期底层根系；21：成熟期底层根系；22：花蕾形成期中层根系； 23：营养生长期1 cm 的茎； 24：幼嫩期2 mm 的茎； 25：开花期茎中部节间；26：成熟期茎中部节间；27：花蕾形成期上方处于生长状态的节间； 28：花蕾形成期处于生长状态的节间；29：花蕾形成期成熟节间； 30：开花期下方圆锥花序；31：开花期上方圆锥花序；32：花蕾形成期圆锥花序；33：花蕾形成期花梗；34：成熟期干种子；35：成熟期湿种子1：Growing leaves at immature stage；2：Below rolled leaves at vegetative stage；3：Below leaves at immature stage;4：Central rolled leaves at vegetative stage;5：Upper rolled leaves at vegetative stage; 6：Upper leaves at immature stage;7：Below growing leaves at flowering stage；8：Below growing leaves at floral initiation stage；9：Below growing leaves at mature stage；10： Growing leaf sheath at flouring stage; 11：Growing leaf sheath at floral initiation stage;12：成Growing leaf sheath at mature stage； 13：Upper growing leaves at flowering stage；14：Upper growing leaves at floral initiation stage；15：Bottom root at immature stage；16：Bottom root at vegetative stage；17：Surface root at immature stage； 18：Surface root at vegetative stage； 19：Bottom root at flowering stage；20：Bottom root at floral initiation stage；21：Bottom root at mature stage22：Middle root at floral initiation stage；23：1 cm stem at vegetative stage；24：2 mm stem at immature stage 25：Middle internode of stem at flowering stage；26：Middle internode of stem at grain maturity stage；27：Upper growing internode at floral initiation stage； 28：Growing leaf sheath at floral initiation stage；29：Mature internode at floral initiation stage； 30：Below panicle at flowering stage；31：Upper panicle at flowering stage；32：Panicle at floral initiation stage；33：Peduncle at floral initiation stage；34：Dry seed at mature stage；35：Wet seed at maturity stage

2.5.2 低温胁迫下的表达 由图7可看出，当高粱幼苗低温处理12 h时，耐冷型高粱9-LOX亚族中的SbLOX1、SbLOX3、SbLOX5和13-LOX亚族中的SbLOX4、SbLOX7上调表达；当高粱幼苗低温处理24 h时，耐冷型高粱9-LOX亚族中的SbLOX1、SbLOX3、SbLOX5和13-LOX亚族中的SbLOX4、SbLOX9依然上调表达；当高粱幼苗低温处理72 h时，耐冷型高粱中仅有13-LOX中SbLOX4和SbLOX9上调表达，且13-LOX中的SbLOX9在敏感型高粱中也上调表达。综上，SbLOX1、SbLOX3、SbLOX4、SbLOX5、SbLOX9基因可能在低温响应中具有重要作用。

图7 高粱LOX家族基因在低温下的表达分析Fig.7 Expression of LOX family genes in sorghum under cold stress

3 结论与讨论

1932 年LOX基因首次在大豆中被报道[17]，之后在多种植物及动物、藻类、真菌中都被发现[1]。研究表明，LOX基因在植物整个生长周期都有不同程度的表达，包括种子萌发、果实成熟以及衰老等过程[18-19]，本研究对高粱中11个LOX基因在高粱不同生长时期各个组织部位的表达量分析中也得到印证，9-LOX亚家族和13-LOX亚家族中的各个基因在高粱植株不同时期组织部位中均有不同程度的表达。

膜脂过氧化被认为是一个对植物有害的过程[20]，但通过植物LOX代谢途径产生的许多代谢产物在抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用[21]，如LOX催化合成重要的信号分子茉莉酸甲酯和氧化脂质，在植物的生长发育过程中响应各种非生物胁迫和生物胁迫[22-23]。北方地区作物早春易受低温影响导致减产，高粱在北方地区被广泛种植，LOX基因响应低温胁迫的研究已有报道，当番茄植株低温(4 ℃)处理时，9-LOX亚族基因成员SlLOX5和SlLOX14以及13-LOX 亚族中SlLOX4在24 h内保持较高表达水平[24]。本研究在高粱中鉴定了11个LOX基因，当高粱幼苗低温处理12 h和24 h时，耐冷型高粱9-LOX亚族中的SbLOX1、SbLOX3、SbLOX5和13-LOX亚族中的SbLOX4、SbLOX9均呈上调表达；当高粱幼苗低温处理72 h时，耐冷型高粱13-LOX亚族中的SbLOX4和SbLOX9依然上调表达，结果与前人研究相符，LOX基因响应低温胁迫。

本研究利用生物信息学的技术和手段共鉴定出11个高粱LOX家族基因，分为9-LOX与13-LOX 2个亚家族。高粱LOX家族基因结构保守，不同亚家族保守基序不存在差异性。高粱LOX基因在根、茎、叶、花序、种子中均有不同水平的表达，且一些成员对低温胁迫有明显的响应，推测该家族基因在高粱不同发育阶段和适应低温胁迫中发挥着重要作用。