谢鹏昊 张 超 文 涛 牛国庆 洪文丹 袁 军* 沈其荣

(1.南京农业大学 资源与环境科学学院，南京 210095；2.南京农业大学 江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室，南京 210095；3.江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心，南京 210095)

青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)所引发的植物土传病害，素有植物“癌症”之称。其广泛分布于热带、亚热带及温带地区的国家，具有发病率高、危害大等特点。青枯菌的宿主种类繁多，包括马铃薯、番茄、辣椒和烟草等在内的53 个科、300 多种植物[1-2]。目前与青枯病相关文献大多集中于病害的发生、传播和防治[3]，而对青枯病研究领域演进历程、发展概况介绍较少。

面对海量的文献，以传统阅读方式对文献进行归类与总结往往存在着一定局限性。近年来随着计算机水平与文献计量学的日益完善，通过使用软件对文献信息进行可视化处理进而进行科学图谱的绘制和分析，逐渐引起关注。科学知识图谱是指利用可视化技术，通过数据挖掘、信息分析、图形绘制等一系列方法展示科学知识的发展结构与进程，为学科研究提供切实、有价值的参考[4]。CiteSpace是由美国德雷塞尔大学的陈超美[5-6]教授开发，通过其可实现文献之间的合作网络[7]、关键词突发性[8]、作者共被引[9]、文献共被引[10]等分析。本研究拟采用文献计量法，通过对1985—2019年与青枯病相关的文献进行梳理，阐明青枯病研究领域的基础背景，以及领域的研究现状与发展趋势，以期为后续青枯菌的相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

为客观描述青枯病研究领域概况，本研究以南京农业大学订购的Web of Science(WoS)数据库核心数据合集作为文献来源，以“Ralstoniasolanacearum” or “Pseudomonassolanacearum”为主题词进行数据检索，检索跨度为1985—2019年，截止日期为2019年9月，共计3 002 篇，去重后得到2 987 篇作为本研究的分析样本。

1.2 研究方法

通过CiteSpaceV软件工具对下载数据进行去重后，得到软件所需数据的标准格式，将其数据保存为软件可识别的download-x.txt。将所需数据导入CitesSpace后，timeslicing(时间段)设置为1985—2019年，依次勾选Title、Abstract、Author Keywords，并按照所作合作特征、共现网络分析、共被引分析等图形，分别勾选Author、Institution、Term、Keyword、Category、Reference，按照不同需求设置Top N(年被引排名)与Years Per Slice(跨度)，点击Go实现数据可视化。

2 结果与分析

2.1 年发文数量分析

通过对文献发表数量年份间的统计，可在一定程度上了解青枯菌的研究历程。如图1所示，在1985—1992年期间青枯菌相关研究文献数量呈缓慢增长趋势，随后在1993年与1998年发文量先后出现较大的增长，单年发文量增加超过40 篇，但对青枯病的关注并未持续，随后几年发文数量均有下降，表明研究进入瓶颈期。在2001年后，青枯病成为研究热点发文数量持续稳定增加，在2018年发文量已达到225篇。

图1 Web of science核心数据库中青枯病年发文量统计Fig.1 Annual published papers statistics of bacterial wilt in Web of science core database

2.2 发文国家、机构和作者合作特征分析

CiteSpace可以实现作者合作网络、机构合作网络和国家地区合作网络图形的绘制，通过对图形进行解读可以了解到青枯病研究领域中不同水平的合作关系，进而发现领域内领先的国家、机构和个人[11]。图2为不同国家之间合作图谱，共66 个节点，280 条连线，直观表现出多个国家研究者对青枯病的重视，并且国家之间合作较多。由于青枯病发病区域的特点，对青枯病研究较为深入的国家基本集中于热带、亚热带及温带地区。其中美国不仅对青枯病研究开始最早(1985年)，同时发文量(642 篇)远高于除中国外其他国家(表1)。另外，其中介中心性为0.59，表明美国在青枯病领域居于龙头地位，其所发文献共被引次数远超其余国家，文献总体质量较高。中国对青枯病研究起始于20世纪末，虽开始较晚但发展迅速，在20年间发文数量高达600 篇，仅次于美国，但中介中心性为0.12，表明中国文献数量较多，但是缺少高被引文章(表1)。此外，法国、日本、印度和德国等也均在青枯病领域发表许多优秀论文，近年来多个国家年轮厚度迅速增加，代表其发文数量均迅速增长。

图形大小与文献数量成正比，紫色外圈代表中介中心性，年轮颜色代表发表时间，颜色越深发表时间越远，厚度与文献频率成正相关，节点间的连线代表两者共现或共被引关系。下同。The size of the round node is in direct proportion to the number of papers published. The purple outer circle represents the centrality. Color of the ring represents year of the publication； The darker the color is the earlier is the time to publication of study; Thickness of the ring is positively related to the number of papers. Lines between the nodes represent the co-occurrence or co-citation relationship between the two literatures. The same below.图2 青枯病国家合作网络Fig.2 Cooperative network of bacterial wilt among countries

表1 统计青枯病发文数量前10的国家Table 1 Top 10 countries with the highest number of papers on bacterial wilt

表2展示中介中心性前10机构的发文数量与首发年份，其中中国拥有4 所，美国3 所，法国2所，日本1 所。中介中心性排名第一的机构来自美国威斯康星大学，其首发年份为1998年且主要为独立研究，与其他机构合作较少。法国国家农业研究院发文190 篇，为本领域发表数量最多的机构。我国位于前10的研究机构分别为南京农业大学、中国科学院、中国农业科学院与福建农林大学。其中，南京农业大学中介中心性位列全球机构第五，研究集中于生物防控与根际生态调控。生物防控主要通过筛选植物根际拮抗菌如：木霉、解淀粉芽孢杆菌等，将其制成生物有机肥施入土壤同时结合土壤熏蒸技术，可以有效杀死病原菌改良土壤[12]。根际中病原菌与有益微生物的相互作用影响植物的生长状况，通过对根际微生物组的研究与调控可以实现良好的防控[13]。中国农科院研究更倾向于对青枯菌的相关功能基因与多种植物对病原菌的分子应答机制进行解读[14]。福建农林大学在前10的机构中首次发文最晚(2013)，截至2019年WoS核心数据库已收录相关论文45篇。

表2 青枯病研究中介中心性较高的前10机构Table 2 Top 10 institutions with the high centrality of bacterial wilt research

图3为青枯菌研究领域的作者合作网络图，共917 个节点，2 443 条连线，代表着有917位科研人员关注青枯病，彼此间进行2 443 次合作。早期(1990年以前)的研究者大多以个人为主，合作仅在个体间展开，代表人物为Timothy P. Denny，其主要文献为 Pathogenomics of theRalstoniasolanacearumspecies complex[15]。现代研究往往由少数负责人领导，团队内形成复杂、密切的合作网络，跨团队交流较少，并且研究团队往往由同一机构的科研人员组成。Philippe Prior、Caitilyn Allen、Stephane Genin为青枯病领域中介中心性前3的作者。Philippe Prior中介中心性0.1排名第一，其对青枯病的研究始于1989年，其最新研究为致病菌中efpR基因的突变增强了其对植物的适应能力[16]。其中Alberto P. Macho与青枯病相关的文献首发年份为2017年，发文数量也仅为8篇，但其中介中心性为0.05，排名第5，表明他的研究成果在近几年青枯病领域具有重要意义。进一步分析发现其研究集中于病原体侵染以及植物抵抗侵染的机制：以T3Es功能为切入点，以模式植物拟南芥、烟草和番茄作为研究对象，整合多种生物学手段，通过组织特异性的方式对植物各个进程进行分类，并研究特定的细菌在不同植物器官和不同侵染阶段的毒力因子，解读细菌病原体侵染植物的分子机制、植物应答机制以及相关的植物信号通路[17]。本领域发文最多为Caitilyn Allen，首发年份为1997年，发文104 篇，在近几年仍有论文产出。我国沈其荣教授领导的团队发文量为43篇，排名第三。近年来在其周围形成了数个研究青枯病的小团体，如徐阳春[18]，其研究方向集中于根际有益微生物防控土传病害、根际微生态等。

图3 青枯病作者合作网络Fig.3 Cooperative network of authors on bacterial wilt research

2.3 文献学科分布与关键词共现特征分析

对学科的领域进行共现分析，可构建不同学科间的关系网络，揭示青枯病领域中学科间的相互联系。青枯病学科共现分析网络中(图4)共有57 个节点，表明青枯病领域中有57 个学科相互交叉渗透，294 条代表学科领域间相互联系的连线，表明青枯病研究涉及领域十分复杂。青枯病领域研究主要与植物科学、农学和微生物学交叉。除此之外，和生物化学与分子生物学、生物技术与应用微生物学等领域有较多的交叉研究，说明对青枯病的研究从宏观到微观均有涉猎，多学科领域的交叉对当前研究人员的知识储备提出了更高要求。其中，环境科学、生物技术与应用微生物学农学中介中心性较高分别为0.35、0.27和0.25，表明青枯病在这些学科中有重要的研究价值，相关程度也较高。

图4 青枯病学科领域共现网络Fig.4 Co-occurrence network of bacterial wilt disciplines

文献关键词是文章内容的核心主题，通过对相关文献的关键词进行梳理能够发现该领域的研究热点方向(图5)。出现频次前5关键词代表了所发文献普遍关注的重点：分别是“青枯劳尔氏菌”(R.solanacearum)、“青枯假单胞菌”(P.solanacearum)、“细菌枯萎病”(bacterial wilt)、“番茄”(tomato)和“抗性”(resistance)。本研究检索词条为“Pseudomonassolanacearum”或“Ralstoniasolanacearum”，将其作为青枯病学科演化路径的起点可识别出2个主要方向：1)多种病原菌的鉴别，毒性以及致病机理的研究；2)植物对病原菌的应答机制，相关功能基因的确定，以及病害的防控措施。通过对出现频次和中介中心性较高的关键词进行解读发现，青枯病属于细菌枯萎病，因此对于灾害的防治和致病菌的鉴别是青枯病研究课题的重要内容，其中番茄作为茄科代表作物，同时也为易感青枯病的重要作物，始终受到科研人员关注。

图5 青枯病关键词共现网络Fig.5 Keywords co-occurrence network of bacterial wilt

关键词的突发性描述某一关键词在一段时间内的频次突然增加，反映一段时间内的研究热点和发展趋势。由表3可知，青枯病领域研究热点关键词基本出现在20世纪90年代早期且持续时间较长，前10的突发性关键词的热点中90%持续时间超过6年。1985—2019年，不同作物致病菌出现5 次且持续时间较长，致病菌与作物产量相关，因此其始终为研究热点，对致病菌的研究从抗病到其机理均有涉及。多糖作为突发关键词出现3 次，可能原因为糖诱导并激活植物的免疫系统提高抗病能力。其中持续时间最长的关键词热点为tobacco(烟草)，1991—2008年共18年，烟草为经济作物且易遭受青枯病害，感病后产量严重下降[19]，研究烟草如何应对青枯病与减轻病害，引起科研人员持久关注。

表3 统计突发度前20关键词Table 3 Top 20 keywords for statistical burst

表4展示了2009—2019年的热点关键词转移，通过对突发性关键词的分析，了解研究热点的变化。除致病菌与易感作物始终为研究热点外，与土壤相关研究逐步引起关注。土壤为植物与病原菌的生长提供基础条件，其理化性质与病原菌的关系仍未明确揭示，但随着高通量测序技术的进步，土壤中微生物的组成与功能的面纱将逐渐揭开。由于病原菌在土中的大量繁殖必然造成土壤生态位的改变，因此如何调控植物根际生态来减害、防害为研究重点与热点。由关键词“sequence”、“genetic diversity”、“pathogen”、“gene expression”可识别出当前研究人员更关注病原菌遗传与致病多样性，其中“III secretion system”则反映了对青枯菌致病机理的关注，“Genome sequence of the plant pathogenRalstoniasolanacearum”[20]为其代表性文献被引频次高达936 次，主要描述了菌株GM1000的全基因组序列，并对菌株的III型分泌系统进行解读，进而对致病基因进行预测。

表4 2009—2019年关键词突发性检测Table 4 Keywords burst detection from 2009 to 2019

2.4 文献交叉引用分析

文献共被引表示2篇文献同时被第三篇文献所引，通过对共被引图谱中的聚类和特殊节点进行分析，可以了解该领域的知识脉络[21]。其中被引文献组成了领域的研究基础，相应的引文对应该研究领域的前沿方向[22]。图6的文献共被引图谱由286 个节点和392 条连线形成了8 个较大的群组，其Q值为0.81。7个聚类群组标签代表了青枯病的7 个研究前沿方向，其中前三聚类标签为#0 putative bacterial wilt resistance gene(青枯病抗性基因推测)、#1Ralstoniasolanacearumtype Ⅲ(青枯菌三型分泌系统)、#3 transposon mutagenesis(转座子突变)，这3个聚类标签代表当前青枯病领域中3个研究热点，表明对青枯病的研究已经深入到分子层面，更倾向于对其机理的研究，而不仅仅是作物产量等表观现象。#0 putative bacterial wilt resistance gene中主要关键词为avrbs protein、several cDNA clone、plant defense，主要描述特定基因对植物抗性的功能。代表性文章为Stéphane Genin 2012年发表的“Pathogenomics of theRalstoniasolanacearumspecies complex”，对多种代表性菌株进行基因组测序，了解病原菌的进化与形成过程，探索了菌株致病性与宿主特异性的决定因素，总结了他们的致病机理与调控机制[15]。#1Ralstoniasolanacearumtype Ⅲ中关键词包括pollen polygalacturonase、plant defense、bacterial disease，主要内容为III型分泌系统与植物抗病关系。代表性文章为Stéphane Genin 2010年发表的“Molecular traits controlling host range and adaptation to plants inRalstoniasolanacearum”，通过研究Ⅲ型分泌系统来限制青枯病宿主范围，通过对宿主与细菌通道中基因的协调表达机制变化的研究，来确定其他分子决定因素，包括次级代谢途径、抗菌化合物的合成基因、控制植物激素合成的相关基因[23]。#3 transposon mutagenesis中包括关键词为molecular dialogue、plant cell、avrbs protein，其主要研究内容为细菌相关致病基因。代表性文章为Belen Brito在2002年发表的“prhJandhrpG, two new components of the plant signal-dependent regulatory cascade controlled by PrhA inRalstoniasolanacearum”，GM1000中hrp基因的表达依赖于hrpB调节，外膜蛋白PrhA参与hrp基因的激活，被认为是植物信号转导通路的受体，hrpG和prhJ是完全致病所需，其位于hrp基因右侧。推断PrhA感知到的植物细胞信号被传递到prhJ基因，prhJ表达产物控制hrpG基因的表达，随后在一定的诱导条件下激活hrpB的调节基因，并在诱导条件下激活剩余的hrp转录单位[24]。

图6 青枯病文献共被引图谱Fig.6 Co-cited publications on bacterial wilt

Sigma值与文献结构性与突现性成正相关，其数值越大，文献越可代表学科领域的重点知识。统计Sigma值前10的青枯病相关文献(表5)发现，所有文章均从分子层面入手对青枯病致病菌进行了不同角度的研究，其中4 篇文献研究主要内容为hrp基因的相关作用，2 篇文献与青枯菌Ⅲ型分泌系统相关。hrp基因与III型分泌系统与病原菌致病能力相关，对二者的深入研究有助于了解病原菌对不同宿主植物的适应机理，为限制病原菌的发展提供新思路。

表5 统计青枯病相关文献Sigma值Table 5 Sigma values of bacterial wilt literature

3 讨论与结论

本研究通过使用CiteSpace对WoS核心数据库中相关文献进行分析，进而对青枯病领域研究的起始，发展等进行总结。结果表明：美国与法国在本领域处于领先地位，其拥有学科内顶尖的研究机构与科研人员。其中：美国威斯康星大学的Tans-Kersten等[25]在2001年所发表的文章揭示了青枯菌在早期入侵作物的动力机制；法国农业科学研究院中的Remenant等[26]在2010年所发表的文章介绍了3株番茄致病菌的遗传与致病基因多样性二者均为领域中高被引文献。美国与法国在该研究领域的领先地位，可能是因为两国都有茄科作物种植的悠久历史，多种茄科作物为其重要的蔬菜产品，为适应农业产业的发展需求，促进了青枯病及其相关抗病研究的发展。早在1969年，已有青枯病对农作物造成的巨大危害的报道，并对如何减轻病害的发生提出相关农业措施[27]；1960年发表在Nature上的关于青枯病的研究试图通过对比番茄与香蕉青枯菌的分泌物来阐明其寄主的特异性[28]。我国自1984年来，经济迅速发展，对土地需求不断增强，常年的连作使土壤易爆发病虫害等问题，相关研究得到迅速发展。代表性院校有南京农业大学、中国农业科学院等。由于我国青枯病研究起步较晚，早期研究更偏重实际运用。蔡燕飞等[29]在2003年所发表文章研究不同用量有机肥对番茄青枯病抑制效果和土壤微生物的变化，而对致病机理的研究尚未深入。本研究的分析没有涵盖中文数据库，可能会对我国青枯病的研究现状产生误判，但不影响其在国际上的研究地位分析。

沿时间轴的分析发现，青枯病领域的研究进展与科技发展水平密切相关。学科交叉起始于植物学、农学、微生物学，集中于提高多种易感病作物的抗病性、改善产量等方向。随着近年来高通量测序技术的不断完善，测序深度与精度的逐步提升，研究热点逐步转变到分子层面的研究。包括青枯菌的致病机理[30]、根际微生物生态[31]、植物-病原菌互作机制[32]、植物响应病原菌的分子机制[33]以及植物多种基因的表达对病原菌的影响[34]等研究方向。可以预测，未来植物方面的研究将会继续集中挖掘抗病基因与抗病品种；微生物方面的研究会涉及青枯菌在全球尺度下的遗传多样性与致病多样性，并对病原菌的致病机理进行更详尽的解释。随着微生物组学的快速发展，植物同微生物之间的相互作用的关系越来越明了，在土壤微生物尤其是根际微生物生态方面的研究会得到长足的发展，并通过多组学研究深入解释植物-病原菌互作和调控机制。另外，随着多光谱等技术的发展，植物表型研究进一步成熟，以及在分子领域的研究不断深入，将宏观表型性状和基因组、微生物组等建立关联，有助于及时探测和预防青枯病，实现感染青枯病作物早发现、早预防和精确诊治。

本研究也存在一定的局限性，首先受限于数据库资源，仅选择Web of Science核心数据库，难免造成相关文献的缺失，使统计结果不够准确，进而造成分析偏差；其次，CiteSpace软件可提供多种算法，不同算法产生的结果存在差异，而软件缺少对相关算法的解释造成使用者很难选择最优解进行图形绘制[35]，在后续研究中将加深对算法的理解，以期对文献数据进行更深入的挖掘。